El test de evitación activa de lugares (APA), una tarea de aprendizaje espacial eficaz, versátil y repetible para ratones
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la prueba de evitación activa de lugares, un paradigma de aprendizaje espacial dependiente del hipocampo diseñado para roedores. La alteración de los parámetros clave permite volver a realizar pruebas a los animales antes y después de los tratamientos o con el tiempo.
Abstract
El aprendizaje espacial dependiente del hipocampo en roedores se ha probado utilizando una variedad de métodos. Entre ellas se encuentran las tareas de laberinto acuático de Morris (MWM), laberinto en Y y localización de objetos novedosos (NOL). Más recientemente, la tarea de evitación activa del lugar (APA, por sus siglas en inglés) se ha desarrollado como una alternativa a estos enfoques más tradicionales. En la tarea APA, los ratones deben usar señales espaciales colocadas alrededor de una arena giratoria para evitar una zona de choque estacionaria. Debido a los múltiples parámetros que se pueden ajustar, se ha demostrado que la tarea APA es un enfoque muy versátil. Se presta para ser utilizado longitudinal y repetidamente para la misma cohorte de ratones. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para llevar a cabo con éxito la tarea APA. También destacamos los enfoques alternativos de APA que se pueden utilizar para examinar diferentes componentes del aprendizaje espacial. Describimos los procesos de recolección y análisis de datos. Se discuten los pasos críticos durante la tarea APA para aumentar la probabilidad de realizar con éxito la prueba. La tarea APA tiene varias ventajas sobre las pruebas de navegación espacial más tradicionales. Es apropiado para usar con ratones envejecidos o aquellos con fenotipos de enfermedades como la enfermedad de Alzheimer. La complejidad de la tarea se puede modificar fácilmente, lo que permite probar una amplia gama de cepas de ratón. Además, la tarea APA es adecuada para probar animales que han sido sometidos a cirugía o intervenciones experimentales que pueden haber afectado la función motora o neural, como un accidente cerebrovascular o una lesión cerebral traumática.
Introduction
La evitación activa del lugar (APA) es una herramienta eficaz para evaluar el aprendizaje espacial dependiente del hipocampo en roedores 1,2,3,4. Durante la tarea APA, el animal se coloca en una arena giratoria y se requiere que use señales visuales para orientarse y evitar una zona de choque aversiva5. La rotación de la arena asegura que el ratón no pueda usar un enfoque idiotético para la navegación, ni se pueden usar marcas de olor, ya que estas señales giran en la plataforma mientras que la zona de choque permanece estacionaria5. La alteración de la velocidad y la dirección de la arena, así como la ubicación de la zona de choque y las señales visuales, permite volver a probar a los ratones varias veces6,7,8. El APA ofrece varias ventajas distintivas en comparación con el laberinto acuático de Morris (MWM), una de las pruebas de aprendizaje espacial más utilizadas. Es importante destacar que los ratones tienen aversión a nadar y encuentran la tarea de MWM extremadamente estresante9. Además, se ha informado que ratones envejecidos flotan durante la tarea10 de MWM, lo que la hace inadecuada como tarea de aprendizaje espacial en muchos casos. Además, como la tarea de MWM requiere una plataforma oculta y sumergida para que los ratones la localicen durante las pruebas. Esto requiere que el agua sea opaca, lo que generalmente se logra mediante la adición de pintura blanca. El seguimiento y el análisis de los animales durante las tareas de comportamiento requiere un contraste suficiente entre el sujeto y el entorno, excluyendo ciertas cepas de ratones, como el suizo o el BALB/c, de ser probadas en el MWM. En la tarea APA, este problema se elude mediante la adición de plástico negro debajo de la rejilla.
Se han diseñado múltiples paradigmas APA para probar el aprendizaje espacial, demostrando su utilidad como una herramienta conductual efectiva. Por ejemplo, la adquisición, retención y consolidación del aprendizaje espacial se logra típicamente mediante pruebas diarias de animales que pueden oscilar entre 3 y 5 días 6,7,11,12. La memoria y el aprendizaje se cuantifican comparando el número de choques recibidos cada día de adquisición. El tiempo hasta la primera entrada y el tiempo máximo evitando la zona de choque también son parámetros importantes que se pueden utilizar para determinar los cambios en la capacidad de aprendizaje durante la tarea. Alternativamente, la memoria de trabajo espacial se puede probar mediante la realización de una sola sesión APA de 30 minutos 2,13 donde el aprendizaje espacial se mide como cambios dentro de la sesión comparando el rendimiento, como el número de choque, en intervalos de 5 minutos.
En este artículo, describimos la tarea APA y destacamos las características clave que deben tenerse en cuenta al realizar esta prueba de aprendizaje espacial.
Protocol
Representative Results
Discussion
En conclusión, la prueba de evitación de lugares activos es una tarea efectiva de aprendizaje espacial que se puede utilizar en una variedad de cepas de ratones y condiciones experimentales. La tarea APA supera las limitaciones asociadas con otros paradigmas de aprendizaje espacial14, como el MWM, que es estresante para los ratones medido por los niveles de cortisol9. El MWM tampoco es adecuado para ratones envejecidos, donde se ha informado que flotan durante la tarea10. Aunque otras pruebas de aprendizaje espacial, como el laberinto de Barnes y la prueba de localización de objetos nuevos, son menos estresantes, están limitadas por la frecuencia con la que se pueden realizar pruebas repetidas en la misma cohorte de ratones. Por lo tanto, la principal ventaja de la tarea APA es que se puede utilizar varias veces, ya que se pueden ajustar varios parámetros para mantener la novedad. De hecho, hemos utilizado la tarea APA hasta 5 veces en la misma cohorte de ratones para examinar el efecto de la ablación del hipocampo y el efecto posterior del ejercicio8. En cada caso, los parámetros, incluida la rotación de la arena, la zona de choque y las señales espaciales, se modificaron entre las pruebas. Esto fue efectivo para asegurar que los ratones usaran señales de navegación espacial para volver a aprender la tarea, como lo demostraron los animales de control, comenzando con un alto número de choques y luego disminuyendo durante los días de prueba posteriores para cada período de prueba8. Típicamente, al final de un paradigma de prueba de 5 días, consideramos que cualquier animal que haya recibido más de 10 descargas en el último día o que tenga una evitación máxima de menos de 60 s no ha aprendido el paradigma.
Más allá de la capacidad de modificar fácilmente la configuración para permitir múltiples rondas de pruebas espaciales, la tarea APA garantiza que los ratones deban usar la navegación espacial para evitar eficazmente la zona de choque. Por ejemplo, los animales deben usar señales externas para localizar y evitar entrar en la zona de choque estacionaria alejándose de ella5. A medida que la arena está girando, los animales no pueden usar un enfoque idiotético para la navegación, ni pueden usar señales exteroceptivas como el olor porque estas señales giran con la arena mientras que la zona de choque y las señales espaciales permanecenestacionarias.
También es importante asegurarse de que los ratones estén adecuadamente habituados al ámbito del investigador y de la APA. La intensidad del choque del pie también debe optimizarse, ya que tanto una intensidad de choque demasiado baja como demasiado alta pueden comprometer la capacidad de los ratones para aprender y realizar la tarea5. La intensidad del choque suele ajustarse a 0,5 mA y no debe superar los 0,7 mA. Para los animales que tienen un comportamiento similar a la ansiedad aumentado, considere reducir tanto la intensidad de la luz como la intensidad del choque de las patas. El aumento de la ansiedad durante la tarea APA puede presentarse como saltos excesivos, carrera incontrolada dentro de la arena o congelación prolongada. El protocolo descrito aquí utilizó una intensidad de choque de 0,5 mA, la misma intensidad que se ha utilizado previamente con BALB/c, que se sabe que tiene un comportamiento similar a la ansiedad más alto15.
Aquí, describimos el software de seguimiento de animales suministrado por la empresa que proporcionó la plataforma de evitación de lugares activos utilizada. El software de seguimiento de video alternativo también es adecuado para analizar el rendimiento del comportamiento. Estos programas también pueden medir y analizar con precisión el rendimiento del mouse durante las tareas APA. Estos programas permiten la creación de varias zonas y ubicaciones dentro de la arena APA para evaluar el comportamiento. La configuración de la arena para un APA consta de una zona de choque triangular, donde se mide el número de entradas, el tiempo hasta la primera entrada y el tiempo que se pasa en la zona de choque. También se pueden agregar zonas adicionales dentro de la arena. Por ejemplo, podemos añadir una zona central o una zona opuesta a la zona de choque para medir el tiempo empleado, y la distancia recorrida en esas zonas como estrategia animal para evitar la zona aversiva. Estos programas rastrean el centro de masa del ratón, que luego se guarda y se muestra sobre el marco de referencia para su inspección visual (Figura 6A, B). Por último, también es posible crear un mapa de calor de densidad para el rendimiento individual y grupal (Figura 6C).
Al realizar la tarea APA, existen problemas potenciales que deben abordarse. En ocasiones, los ratones deberán excluirse del análisis debido a la falta de respuesta a la zona de choque. Como siempre, la exclusión solo debe considerarse cuando cumplan con condiciones atípicas predefinidas, por ejemplo, que queden fuera de 2 desviaciones estándar de la media. Las tareas conductuales complejas, como la APA, suelen requerir altos valores de N de los animales. Sugerimos realizar un análisis de potencia para calcular el tamaño de muestra adecuado antes de realizar APA. Esto dependerá de la cepa utilizada y de los grupos de tratamiento. A partir de la experiencia, encontramos que un valor n de 10 o más para cada grupo proporciona suficiente potencia cuando se realizan experimentos APA. El principal problema con esta tarea es garantizar un seguimiento de alta calidad del mouse durante la tarea. La etapa de habituación de la tarea debe usarse para confirmar que esto está ocurriendo. Los ratones que no responden a un choque a menudo se deben a la formación de excrementos entre las barras de la rejilla. Por lo tanto, es esencial limpiar el aparejo después de cada animal y eliminar cualquier excremento u orina. Esto también reducirá el estrés de los animales que siguen. La tarea APA generalmente implica un paradigma de 5 días, lo que puede presentar algunas limitaciones para los estudios que involucran intervenciones efectivas menos de 5 días; Sin embargo, la memoria a corto plazo o la adquisición de aprendizaje espacial aún se pueden evaluar para tales estudios utilizando el enfoque de 30 minutos de una sola sesión.
En resumen, este artículo proporciona una descripción detallada de cómo configurar y utilizar el paradigma de evitación activa de lugares para probar el aprendizaje espacial de ratones. La capacidad de cambiar las condiciones para que se puedan probar múltiples cepas de ratones de diferentes colores es una clara ventaja sobre otras pruebas espaciales más tradicionales, como la MWM. Además, la modificación de múltiples parámetros permite repetir las pruebas para que los cambios en el aprendizaje espacial puedan compararse con precisión durante varios paradigmas experimentales o durante el envejecimiento fisiológico. En un corto período de tiempo, la prueba APA ha demostrado ser una alternativa precisa y efectiva para el aprendizaje espacial dependiente del hipocampo. En el futuro, la tarea APA puede utilizarse como un método fiable para evaluar las intervenciones terapéuticas o de ejercicio sobre el comportamiento cognitivo y espacial tanto en ratones salvajes como transgénicos.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Centro de Comportamiento Animal del Instituto del Cerebro de Queensland (QBI) por el desarrollo y mantenimiento del aparato descrito en este manuscrito.
Materials
| Constant Current Source CS02 | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Control Box | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Ethovision | Noldus | version 16 | Wageningen, Netherlands |
| Shock Scrambler | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
| Track Analysis | BioSignal Group | version 2.2 | Acton, Massachusetts, United States |
| Tracker Programme | BioSignal Group | version: 2.36 | Acton, Massachusetts, United States |
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