アクティブ・プレイス・アホベージョン(APA)テストは、マウスにとって効果的で汎用性が高く、反復可能な空間学習課題です

すべての動物実験は、オーストラリア国立保健医療研究評議会(承認番号:QBI/189/15)のガイドラインに基づき、クイーンズランド大学動物倫理委員会によって承認されました。 1. アパルームのセットアップ 注:APA装置は、高さ32cmの透明な円形の境界で囲まれた金属グリッド床を備えた高架アリーナで構成されています。金属棒は等間隔(0.5cm間隔)で、直径は0.3cmです。 APA装置が天井に取り付けられたカメラフレーム内にあることを確認します。市販の動物追跡ソフトウェアを使用してマウスを追跡します。 APAアリーナは通常1rpmの速度で回転し、回転アリーナ内に事前に指定された60°の固定ショックゾーンが設定されています。マウスが衝撃ゾーンに入ると、0.5 mA(60 Hz、500 ms)の軽度の足の衝撃を与えます。 試験中はショックゾーンの位置が一定であり、実験セットアップ内で電子的に設定されていることを確認してください。回転アリーナは、マウスがそれを避けるために積極的に動かない限り、マウスをショックゾーンに運びます。 回転するプラットフォームと同じ高さ(通常はアリーナから30〜50 cm離れた)にある4つの異なる部屋の壁に、4つの斬新な視覚的手がかりを配置します。手がかりが、A3用紙に印刷された白黒の記号や図形など、中間色で、クリーニングしやすいようにラミネート加工されていることを確認します(図1A)。 部屋の光の強度が30〜70ルクスであることを確認してください.光の強度を上げると、不安のような行動が誘発され、探索が減少します。 開始する前に、トラッカープログラムを開き、APA タスクを選択します。 Tracker 2D の Options で、 Experiment タブを選択します。ここで、[ 回避を配置 – 1 フレーム – 位置のみ ]が選択されていることを確認します。これにより、必要なパラメータを設定できます。設定ファイルを保存し、必要に応じて調整します。 [実験] タブの [実験時間] ボックスで実験期間を設定します。一般的な実験時間は600秒または10分です。 [タイマーを有効にする] が選択されていることを確認します。上記のように、タイマー領域の衝撃パラメータを変更します。 実験タブのルームフレーム領域にあるスペースに、一般的な実験の詳細を入力します。たとえば、デフォルトの出力ファイル名に、日付、単純な実験識別子、およびテスト日が入力されていることを確認します。名前をアンダースコア「_」で終わらせると、実験中に一意のマウスIDを追加できるようになります。 ルームフレーム領域には、ターゲットタブもあります。[編集] ボタンをクリックすると、アリーナ全体が対象地域に含まれるようになります。次に、[Arc]を選択して、衝撃ターゲットゾーンのサイズと位置の調整可能なパラメータを指定します(図1B)。 [トラッキング] タブを開き、マウスのトラッキングが成功するようにパラメータを調整します。コントラストボックスには、暗いマウス(C57Bl / 6など)または明るいマウス(BALB / cなど)の両方を可能にするダークまたはライトオプションがあります。これにより、背景とマウスの間に効果的なコントラストが生まれます。マウスのアルビノ株を使用する場合は、このコントラストを実現するために、アリーナの下に黒いプラスチック片を置きます(図2)。 この領域のマウスのサイズと面積範囲を設定します。これらのパラメータを設定すると、アリーナ内でマウスを効果的に認識できます。または、 キャリブレーターボタンから 押した後にこれらを設定します。 キャリブレーターから ボタンを選択して、アリーナが完全に関心領域マスク内にあることを確認します。このタブでアリーナを起動して、アリーナが回転したときにアリーナがマスクに留まるようにします。このタブは、適切なコントラストしきい値を選択するためにも重要です。 [しきい値 ] ペインの赤い線を移動して、コントラストのしきい値を調整します。メモ: 図 3A は、マウスが配置されているオレンジ色の実線領域と青色の「X」で証明される最適なしきい値の選択を示しています。 図3B に低いしきい値が示されており、オレンジ色の斑点のみが表示され、「X」は表示されません。 仕掛け タブを使い、速度ボタンでアリーナの回転方向と速度を設定します。正と負の両方の速度を選択し、時計回りと反時計回りの回転を表します。「電流源 (Current Source)」セクションで衝撃の強さを設定します。マウスの最も一般的な設定は、1rpmの回転と0.5mAのショックです。 「電流源」タブ内でショックを配信する方法やタイミングを変更します。[現在のモード] が [依存の追跡] に選択されていることを確認します。これにより、マウスがショックゾーンに移動したときに感電します。 ユーザーが設定した時間間隔で衝撃を与えるには、[ 時間 ] を選択します。以前に録音したトラックを使用して、 ファイルからを選択してマウスに衝撃を与えます。これは、空間学習とは無関係に、同じ持続時間および強度で同じ数の衝撃を受けるヨーク制御マウスを提供するためである。メモ: File Output(ファイル出力)タブと Window(ウィンドウ)タブでは、データファイルやビデオファイルを特定のディレクトリに保存できます。[ファイル出力] タブ内の [画像から] ボタンを使用すると、対象領域をキャプチャしてアリーナ全体を選択することもできます。 カーテンの後ろに退き、裁判を始めましょう。実験者がアリーナの近くにいることや、不必要な騒音は、動物のパフォーマンスに影響を与える可能性があります。 試験中は、マウスに別の手がかりを与え、性能に影響を与える可能性のあるノイズや臭いを制限してください。これを最小限に抑える例としては、臨床用ゴミ箱を密閉する、騒がしいラボスペースから離れた部屋を使用する、マウス間で機器を徹底的に清掃するなどがあります。研究者は、ホワイトノイズ発生器を使用して、無関係な外部ノイズをマスクすることを検討するかもしれません。 ホームケージの寝具は、新しい刺激を与え、行動に影響を与える可能性があるため、行動テスト期間中は同じままにしてください。 日中の変動を避けるために、毎日一定の時間にテストを実施します。 2. 実験者の取り扱いへの慣れ 各マウスを毎日30秒から1分間、少なくとも2〜3日間取り扱ってください。動物の取り扱いは、試験中のストレスや不安に関連する行動を大幅に軽減します。 同じ白衣を使用し、慣れやテスト中は強力な消臭剤、コロン、香水を着用しないでください。 3. APAアリーナへの慣れ(1日) マウスを控え室または試験室に持ち込んで慣れさせます。マウスを最低30分間慣らしたままにします。マウスを慣れさせる前に、控え室または試験室で光の強度を設定します。 Tracker ソフトウェアをセットアップします。実験専用のフォルダを作成します。実験パラダイムに応じて、日または試行ごとに個別のフォルダーを用意します。上記のように実験構成を設定し、これらの構成を保存して後で使用します。 体験版を開始する前に、[ ファイル ] タブをクリックして保存した設定を開き、[ 保存 ] 記号をクリックし、新しく開いたウィンドウに一意のマウス ID を追加し、[ 再生 ] タブを押して体験版を実行します。 マウスをAPA装置に慣れさせ、衝撃を与えずに回転アリーナに5分間さらします。 マウスをテールの付け根から持ち上げ、手袋をはめた手にそっと置き、ホームケージからマウスを取り外します。マウスをAPA装置に輸送し、ショックゾーンから離れて壁に面して置きます。 カーテンの後ろに退き、裁判を始めましょう。 テストの最後に、マウスを取り外してホームケージに戻します。 すべての尿とスキャットを収集し、80%(v / v)エタノールでグリッドを完全に洗浄します。 すべてのマウスについて、手順3.4〜3.7を繰り返します。 4. APAを用いた習得研修(1〜6日間) 部屋の照明を慣れ日と同じ条件に設定します。 マウスを控え室または試験室に持ち込み、最低30分間慣れさせます。 上記のようにトラッカーソフトウェアをセットアップします。 試用期間を設定します。 電流源がオンになっていて、設定されていることを確認します(つまり、0.5 mA)。 マウスをショックゾーンから離れ、壁に面したアリーナに置きます。 カーテンの後ろに隠れて、 再生 ボタンを押してトライアルを開始します。コンピュータ画面上のマウスを監視し、必要に応じて操作します。たとえば、マウスはショックを受けていないか、過度のジャンプや発声によって証明されるように、過度にストレスを感じているように見えます。 テストの最後に、マウスを取り外してホームケージに戻します。注:マウスがショックを受け、反応していることを確認してください。マウスは、後ろに下がって発声することでショックに反応します。そうでなければ、ショックを受けていない可能性があります。これは、グリッド上のスキャットまたは不十分な追跡が原因である可能性があります。したがって、各試行後にグリッドをクリーニングし、前述のようにマウストラッキングを最適化することが不可欠です。 5.逆転取得トレーニング(オプション、1〜6日) 反転タスクでは、ショックゾーンを新しい位置(通常は前の位置から180°)に再配置します。新しいショックゾーンの位置を柔軟に学習するマウスの能力を評価します。部屋の手がかりは、通常、反転学習中には変更されません。 すべてのマウスについて、手順3.4〜3.7を繰り返します。 6.プローブトライアル(オプション、1日) プローブトライアルでは、最初の侵入までの時間および/またはショックゾーンを回避する最大時間を測定します。メモ: これは、取得フェーズ後のメモリ統合を示します。よく訓練されたマウスは、長時間(>60秒)ショックゾーンに入ることを避け、空間学習の証拠を示します。 取得トレーニング日のように室内光量を設定します。 マウスを試験室または控え室で30分間慣らします。 Tracker ソフトウェアをセットアップします。 試行期間を、以前に実施したテスト期間と同じ時間に設定します (たとえば、試行パラメーターに応じて 10 分または 30 分)。 この裁判ではショックを与えないでください。 マウスを嫌悪衝撃ゾーンの反対側に、壁に向けて置きます。 裁判を開始し、カーテンの後ろに退却します。 マウスが効率的に追跡されていることを確認してください。 コンピューター画面上のマウスを監視し、ショックゾーンに入ったらトライアルを停止します。一部の研究者は、マウスがショックゾーンに戻り続けるかどうかを確認するために、試験を5分間続けることを好みます。 マウスをそっと手に取り、ホームケージに戻ります。 すべての尿とスキャットが収集され、グリッドが80%(v / v)エタノールで完全に洗浄されていることを確認してください。 7. トラック分析 注:タスクのパフォーマンスは、さまざまな追跡ソフトウェアを介して実現できます。以下は、付属のソフトウェアを使用してAPAタスク中のパフォーマンスを判断する方法です。この場合、 トラック分析 プログラムを使用してデータが分析されます。 データを分析するには、 トラック分析 プログラムを開き、メインウィンドウの ドロップダウンメニューから回避 を選択します。 [タスクの追加]をクリックして、取得フェーズ中に保存されたデータファイルを新しいウィンドウにアップロードします。[グループ名] で、分析するグループ (例: 1 日目や分析の時刻) を作成します。 [出力ディレクトリ] をクリックして、分析されたデータを保存する場所を選択します。 [ ファイルの追加 ]タブをクリックし、ローカルドライブからファイルを選択して、分析するファイルを追加します。 [ 時間の設定 ] タブをクリックして、解析する時間を設定します。これにより、分析する期間、つまり0〜600秒を定義できます。または、ビン (60 秒) でデータを分析します。 すべてのトラックを追加したら、[ 解析 ] タブをクリックし、[ 解析の実行 ] を選択してデータを解析します。分析では、いくつかのフォルダーが生成されます。分析用のデータは 、TBLfiles フォルダーにあります。これらのデータファイルをスプレッドシートで開き、ペアワイズ比較や反復測定ANOVAなどのさらなる分析に使用します。注:分析では、テスト中のマウスの1ページの説明を含むPSファイルを含む他のフォルダーも生成され、トレースマップとショックが受け取られた場所が表示されます。