Summary

בידוד מעיים מזחלי דגי זברה לריצוף RNA חד-תאי

Published: November 10, 2023
doi:

Summary

במאמר זה אנו מתארים שיטה לבידוד מעיים מזחלי דגי זברה 5 ימים לאחר ההפריה, לצורך ניתוח ריצוף RNA חד-תאי.

Abstract

מערכת העיכול מבצעת מגוון תפקודים חיוניים לחיים. פגמים מולדים המשפיעים על התפתחותה יכולים להוביל להפרעות נוירומוסקולריות אנטריות, המדגישות את החשיבות להבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התפתחות מערכת העיכול ותפקוד לקוי. במחקר זה, אנו מציגים שיטה לבידוד מעיים מזחלי דגי זברה 5 ימים לאחר ההפריה כדי להשיג תאים חיים וברי קיימא אשר יכולים לשמש לניתוח ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq). פרוטוקול זה מבוסס על דיסקציה ידנית של המעי של דג הזברה, ואחריה דיסוציאציה אנזימטית עם פפאין. לאחר מכן, תאים נשלחים למיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות, ותאים בני קיימא נאספים עבור scRNA-seq. בשיטה זו הצלחנו לזהות בהצלחה סוגים שונים של תאי מעי, כולל תאי אפיתל, סטרומה, דם, שרירים ומערכת החיסון, כמו גם תאי עצב אנטריים ותאי גליה. לכן, אנו רואים את זה להיות משאב יקר ערך לחקר הרכב מערכת העיכול בבריאות ומחלות, באמצעות דג הזברה.

Introduction

מערכת העיכול (GI) היא מערכת מורכבת הממלאת תפקיד חיוני בבריאות וברווחה הכללית. הוא אחראי על העיכול והספיגה של חומרים מזינים, כמו גם חיסול של מוצרי פסולת 1,2. מערכת העיכול מורכבת ממספר סוגי תאים, כולל תאי אפיתל, תאי שריר חלק, תאי מערכת החיסון ומערכת העצבים האנטרית (ENS), אשר מתקשרים באופן הדוק זה עם זה כדי לווסת ולשמור על תפקוד מעיים תקין 3,4,5. לפגמים בהתפתחות מערכת העיכול יכולות להיות השפעות מרחיקות לכת על היבטים שונים כגון ספיגת חומרים מזינים, הרכב המיקרוביוטה, ציר המעי-מוח וה-ENS, מה שמוביל למספר הפרעות נוירומוסקולריות אנטריות, כגון מחלת הירשפרונג וחסימת מעיים כרונית 6,7. הפרעות אלה מאופיינות בחוסר תנועתיות חמור של המעי הנגרם על ידי שינויים בתאי מפתח שונים, כגון תאי interstitial של Cajal, תאי שריר חלק, ואת ENS 6,8,9. עם זאת, המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התפתחות מערכת העיכול ותפקוד לקוי עדיין אינם מובנים היטב.

דג הזברה הוא אורגניזם מודל רב ערך לחקר התפתחות מערכת העיכול ותפקוד לקוי שלה בשל התפתחותה העוברית המהירה, שקיפותה בשלבים עובריים וזחליים, ויכולת גנטית 10,11,12,13,14. קיימים קווי דגי זברה טרנסגניים רבים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים. דוגמה לקו כזה היא דג הזברה tg(phox2bb:GFP), המשמש בדרך כלל לחקר ENS, שכן כל תאי phox2bb+, כולל נוירונים אנטריים, מסומנים15,16. כאן, באמצעות קו דגי הזברה tg (phox2bb:GFP), אנו מציגים שיטה לבידוד מעיים של זחלי 5 ימים לאחר ההפריה (dpf) לצורך ניתוח ריצוף רנ”א חד-תאי (scRNA-seq) (איור 1).

Protocol

כל גידול דגי הזברה והניסויים נערכו על פי ההנחיות המוסדיות של ארסמוס MC וחקיקת רווחת בעלי חיים. השימוש בזחלי דגי זברה 5 ימים לאחר ההפריה נופל תחת הקטגוריה של ניסויים שאינם דורשים אישור אתי רשמי, כפי שנקבע בתקנות ההולנדיות. 1. השגת 5 ימים לאחר ההפריה (dpf) זחלי בר ו-tg (phox2bb:GFP)…

Representative Results

בעזרת פרוטוקול זה השגנו בידוד ודיסוציאציה מוצלחים של מעיים שלמים מ-5 זחלי dpf. באמצעות שימוש בפפאין כאנזים דיסוציאציה, שיפרנו באופן משמעותי את יכולת הקיום של התא, ואפשרנו לכידה של 46,139 אירועים המערבים תאים יחידים בני קיימא (6.4% מכלל התאים) מתוך 244 מעי מבודדים (איור 2A). זחלי הבר ה?…

Discussion

כאן, אנו מציגים שיטה לבידוד ודיסוציאציה של המעיים של 5 זחלי דגי זברה dpf באמצעות FACS. בשיטה זו, סוגי תאי מעיים שונים נאספו ונותחו בהצלחה על ידי scRNA-seq, תוך שימוש בפלטפורמת 10x Genomics Chromium. בחרנו בקו דגי הזברה tg (phox2bb:GFP), מאחר שרצינו אינדיקציה לכך שגם תאי ENS בני קיימא יבודדו (איור 2D)…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי ידידי קרן סופיה (SSWO WAR-63).

Materials

10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) Sigma 59418C
5 mL round bottom tube with cell-strainer cap Falcon 352235
Agarose Sigma-Aldrich A9539
BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap BD Biosciences 352054
Cell Ranger v3.0.2 10X Genomics N/A
DAPI Sigma-Aldrich Cat#D-9542
Dissection microscope Olympus SZX16
FACSAria III sorter machine BD Biosciences N/A
HBSS with CaCl2 and MgCl2 Gibco 14025050
Insect pins Fine Science Tools 26000-25
L-Cysteine Sigma C7352
MS-222, Tricaine Supelco A5040-250G
Papain Sigma P4762
Seurat v3 Stuart et al. (2019) N/A
Trypan blue  Sigma  Cat#T8154

References

  1. Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses. Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).
  2. Sitrin, M. . The Gastrointestinal System. , (2014).
  3. Furness, J. B. The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).
  4. Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).
  5. Obata, Y., Pachnis, V. The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system. Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).
  6. Heuckeroth, R. O. Hirschsprung disease – integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).
  7. Antonucci, A., et al. Chronic intestinal pseudo-obstruction. World Journal of Gastroenterology. 14 (19), 2953-2961 (2008).
  8. De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction. Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).
  9. Bianco, F., et al. Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction. Biomolecules. 12 (12), 1849 (2022).
  10. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  11. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
  12. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  13. Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).
  14. Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).
  15. Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish. Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).
  16. Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073 (2020).
  17. Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
  18. Kuil, L. E., et al. Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level. iScience. 26 (7), 107070 (2023).
  19. Gao, Y., et al. Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver. Cells. 11 (20), 3290 (2022).
  20. Jin, Q., et al. Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification. Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).
  21. Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine. Cell Reports. 38 (5), 110311 (2022).
  22. Kline, M. . Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants. , (2016).
  23. Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia. Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).
  24. Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres. Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617 (2016).

Play Video

Cite This Article
Kakiailatu, N. J. M., Kuil, L. E., Bindels, E., Zink, J. T. M., Vermeulen, M., Melotte, V., Alves, M. M. Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (201), e65876, doi:10.3791/65876 (2023).

View Video