Darmisolatie van zebravislarven voor eencellige RNA-sequencing
Summary
Hier beschrijven we een methode voor darmisolatie van zebravislarven 5 dagen na de bevruchting, voor single-cell RNA sequencing analyse.
Abstract
Het maagdarmkanaal (GI) vervult een reeks functies die essentieel zijn voor het leven. Aangeboren afwijkingen die de ontwikkeling beïnvloeden, kunnen leiden tot enterische neuromusculaire aandoeningen, wat het belang benadrukt om de moleculaire mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en disfunctie van het maagdarmkanaal. In deze studie presenteren we een methode voor darmisolatie van zebravislarven 5 dagen na de bevruchting om levende, levensvatbare cellen te verkrijgen die kunnen worden gebruikt voor single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analyse. Dit protocol is gebaseerd op de manuele dissectie van de darm van de zebravis, gevolgd door enzymatische dissociatie met papaïne. Vervolgens worden cellen onderworpen aan fluorescentie-geactiveerde celsortering en worden levensvatbare cellen verzameld voor scRNA-seq. Met deze methode waren we in staat om met succes verschillende darmceltypen te identificeren, waaronder epitheel-, stromale, bloed-, spier- en immuuncellen, evenals enterische neuronen en glia. Daarom beschouwen we het als een waardevolle bron voor het bestuderen van de samenstelling van het maagdarmkanaal in gezondheid en ziekte, met behulp van de zebravis.
Introduction
Het maagdarmkanaal (GI) is een complex systeem dat een vitale rol speelt in de algehele gezondheid en het welzijn. Het is verantwoordelijk voor de vertering en opname van voedingsstoffen, evenals de eliminatie van afvalproducten 1,2. Het maagdarmkanaal bestaat uit meerdere celtypen, waaronder epitheelcellen, gladde spiercellen, immuuncellen en het enterische zenuwstelsel (ENS), die nauw met elkaar communiceren om een goede darmfunctie te reguleren en te behouden 3,4,5. Defecten in de ontwikkeling van het maagdarmkanaal kunnen verstrekkende gevolgen hebben voor verschillende aspecten, zoals de opname van voedingsstoffen, de samenstelling van de microbiota, de darm-hersenas en het ENS, wat leidt tot verschillende enterische neuromusculaire aandoeningen, zoals de ziekte van Hirschsprung en chronische intestinale pseudo-obstructie 6,7. Deze aandoeningen worden gekenmerkt door ernstige darmdysmotiliteit veroorzaakt door veranderingen in verschillende sleutelcellen, zoals de interstitiële cellen van Cajal, gladde spiercellen en de ENS 6,8,9. De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en disfunctie van het maagdarmkanaal worden echter nog steeds slecht begrepen.
De zebravis is een waardevol modelorganisme voor het bestuderen van de ontwikkeling en disfunctie van het maagdarmkanaal vanwege de snelle embryonale ontwikkeling, transparantie tijdens embryonale en larvale stadia en genetische traceerbaarheid 10,11,12,13,14. Er zijn talrijke transgene zebravislijnen beschikbaar die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen. Een voorbeeld van zo’n lijn is de tg(phox2bb:GFP) zebravis, die vaak wordt gebruikt om het ENS te bestuderen, aangezien alle phox2bb+-cellen, inclusief enterische neuronen, het label15,16 hebben. Hier presenteren we, met behulp van de tg(phox2bb:GFP) zebravislijn, een methode voor darmisolatie van 5 dagen na bevruchting (dpf) larven voor single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analyse (Figuur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier presenteren we een methode voor isolatie en dissociatie van de darm van 5 dpf zebravislarven met behulp van FACS. Met deze methode werden verschillende darmceltypen met succes verzameld en geanalyseerd door scRNA-seq, met behulp van het 10x Genomics Chromium-platform. We selecteerden de tg(phox2bb:GFP) zebravislijn, omdat we een indicatie wilden dat levensvatbare ENS-cellen ook geïsoleerd zouden worden (Figuur 2D). Het is echter belangrijk op te merken dat deze methode gemakke…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de Vrienden van de Sophia Stichting (SSWO WAR-63).
Materials
| 10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) | Sigma | 59418C | |
| 5 mL round bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap | BD Biosciences | 352054 | |
| Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
| Dissection microscope | Olympus SZX16 | ||
| FACSAria III sorter machine | BD Biosciences | N/A | |
| HBSS with CaCl2 and MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| MS-222, Tricaine | Supelco | A5040-250G | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | Cat#T8154 |
References
- Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses. Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).
- Sitrin, M. . The Gastrointestinal System. , (2014).
- Furness, J. B. The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).
- Obata, Y., Pachnis, V. The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system. Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).
- Heuckeroth, R. O. Hirschsprung disease – integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).
- Antonucci, A., et al. Chronic intestinal pseudo-obstruction. World Journal of Gastroenterology. 14 (19), 2953-2961 (2008).
- De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction. Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).
- Bianco, F., et al. Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction. Biomolecules. 12 (12), 1849 (2022).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).
- Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).
- Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish. Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).
- Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073 (2020).
- Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Kuil, L. E., et al. Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level. iScience. 26 (7), 107070 (2023).
- Gao, Y., et al. Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver. Cells. 11 (20), 3290 (2022).
- Jin, Q., et al. Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification. Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).
- Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine. Cell Reports. 38 (5), 110311 (2022).
- Kline, M. . Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants. , (2016).
- Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia. Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).
- Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres. Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617 (2016).
