Isolamento intestinale da larve di pesce zebra per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula
Summary
Qui, descriviamo un metodo per l’isolamento intestinale da larve di pesce zebra a 5 giorni dopo la fecondazione, per l’analisi del sequenziamento dell’RNA a singola cellula.
Abstract
Il tratto gastrointestinale (GI) svolge una serie di funzioni essenziali per la vita. I difetti congeniti che ne influenzano lo sviluppo possono portare a disturbi neuromuscolari enterici, evidenziando l’importanza di comprendere i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della disfunzione gastrointestinale. In questo studio, presentiamo un metodo per l’isolamento intestinale da larve di zebrafish a 5 giorni dopo la fecondazione per ottenere cellule vive e vitali che possono essere utilizzate per l’analisi del sequenziamento dell’RNA a singola cellula (scRNA-seq). Questo protocollo si basa sulla dissezione manuale dell’intestino del pesce zebra, seguita dalla dissociazione enzimatica con la papaina. Successivamente, le cellule vengono sottoposte a selezione cellulare attivata dalla fluorescenza e le cellule vitali vengono raccolte per scRNA-seq. Con questo metodo, siamo stati in grado di identificare con successo diversi tipi di cellule intestinali, tra cui cellule epiteliali, stromali, del sangue, muscolari e immunitarie, nonché neuroni enterici e glia. Pertanto, lo consideriamo una risorsa preziosa per studiare la composizione del tratto gastrointestinale in salute e malattia, utilizzando il pesce zebra.
Introduction
Il tratto gastrointestinale (GI) è un sistema complesso che svolge un ruolo fondamentale nella salute e nel benessere generale. È responsabile della digestione e dell’assorbimento dei nutrienti, nonché dell’eliminazione dei prodotti di scarto 1,2. Il tratto gastrointestinale è composto da più tipi di cellule, tra cui cellule epiteliali, cellule muscolari lisce, cellule immunitarie e sistema nervoso enterico (ENS), che comunicano strettamente tra loro per regolare e mantenere la corretta funzione intestinale 3,4,5. I difetti nello sviluppo del tratto gastrointestinale possono avere effetti di vasta portata su vari aspetti come l’assorbimento dei nutrienti, la composizione del microbiota, l’asse intestino-cervello e l’ENS, portando a diversi disturbi neuromuscolari enterici, come la malattia di Hirschsprung e la pseudo-ostruzione intestinale cronica 6,7. Questi disturbi sono caratterizzati da una grave dismotilità intestinale causata da alterazioni in varie cellule chiave, come le cellule interstiziali di Cajal, le cellule muscolari lisce e l’ENS 6,8,9. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della disfunzione gastrointestinale sono ancora poco compresi.
Il pesce zebra è un prezioso organismo modello per lo studio dello sviluppo e della disfunzione gastrointestinale grazie al suo rapido sviluppo embrionale, alla trasparenza durante le fasi embrionali e larvali e alla trattabilità genetica 10,11,12,13,14. Sono disponibili numerose linee di zebrafish transgenici che esprimono proteine fluorescenti. Un esempio di tale linea è il pesce zebra tg(phox2bb:GFP), comunemente usato per studiare l’ENS, poiché tutte le cellule phox2bb+, compresi i neuroni enterici, sono marcate15,16. Qui, utilizzando la linea di zebrafish tg(phox2bb:GFP), presentiamo un metodo per l’isolamento intestinale di larve 5 giorni dopo la fecondazione (dpf) per l’analisi del sequenziamento dell’RNA a singola cellula (scRNA-seq) (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, presentiamo un metodo per l’isolamento e la dissociazione dell’intestino di 5 larve di pesce zebra dpf utilizzando FACS. Con questo metodo, diversi tipi di cellule intestinali sono stati raccolti e analizzati con successo da scRNA-seq, utilizzando la piattaforma 10x Genomics Chromium. Abbiamo selezionato la linea di zebrafish tg(phox2bb:GFP), in quanto volevamo un’indicazione che anche le cellule ENS vitali sarebbero state isolate (Figura 2D). Tuttavia, è importante notare che…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione Amici di Sophia (SSWO WAR-63).
Materials
| 10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) | Sigma | 59418C | |
| 5 mL round bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap | BD Biosciences | 352054 | |
| Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
| Dissection microscope | Olympus SZX16 | ||
| FACSAria III sorter machine | BD Biosciences | N/A | |
| HBSS with CaCl2 and MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| MS-222, Tricaine | Supelco | A5040-250G | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | Cat#T8154 |
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