シングルセルRNAシーケンシングのためのゼブラフィッシュ幼生からの腸管分離
1Department of Clinical Genetics,Erasmus University Medical Center – Sophia Children’s Hospital, 2Division of Psychosocial Research and Epidemiology,the Netherlands Cancer Institute, 3Department of Hematology,Erasmus Medical Center, 4Department of Pathology, GROW-School for Oncology and Developmental Biology,Maastricht University Medical Center
Summary
ここでは、ゼブラフィッシュ仔魚の受精後5日目の腸管分離法について、シングルセルRNAシーケンシング解析法について述べる。
Abstract
消化管は、生命に不可欠なさまざまな機能を果たしています。その発達に影響を与える先天性欠損は、腸管性神経筋障害につながる可能性があり、消化管の発達と機能障害の根底にある分子メカニズムを理解することの重要性を強調しています。本研究では、ゼブラフィッシュ仔魚を受精後5日目に腸管から分離し、シングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)解析に使用できる生細胞を採取する方法を紹介します。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの腸の手動解剖と、それに続くパパインとの酵素解離に基づいています。その後、細胞を蛍光活性化セルソーティングにかけ、生細胞をscRNA-seq用に収集します。この方法により、上皮細胞、間質細胞、血液細胞、筋肉細胞、免疫細胞、腸神経細胞、グリアなど、さまざまな種類の腸細胞を同定することに成功しました。したがって、ゼブラフィッシュを使用して、健康と病気における消化管の組成を研究するための貴重なリソースであると考えています。
Introduction
消化管は、全体的な健康と幸福に重要な役割を果たす複雑なシステムです。それは栄養素の消化と吸収、そして老廃物の除去に関与しています1,2。消化管は、上皮細胞、平滑筋細胞、免疫細胞、腸神経系(ENS)など、複数の細胞タイプで構成されており、これらは密接に通信して適切な腸機能を調節および維持しています3,4,5。消化管の発達における欠陥は、栄養吸収、微生物叢組成、腸脳軸、ENSなどのさまざまな側面に広範囲に影響を及ぼし、ヒルシュスプルング病や慢性腸偽閉塞などのいくつかの腸管性神経筋障害につながる可能性があります6,7。これらの障害は、カハールの間質細胞、平滑筋細胞、ENS 6,8,9などのさまざまな主要細胞の変化によって引き起こされる重度の腸管運動障害を特徴としています。しかし、消化管の発達と機能障害の根底にある分子メカニズムはまだよくわかっていません。
ゼブラフィッシュは、胚発生の速さ、胚期および幼生期の透明性、遺伝的扱いやすさ10,11,12,13,14により、消化管の発達と機能障害を研究するための貴重なモデル生物です。蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュ系統が多数存在します。このような系統の例は、腸ニューロンを含むすべてのphox2bb+細胞が15,16と標識されているため、ENSの研究に一般的に使用されるtg(phox2bb:GFP)ゼブラフィッシュです。ここでは、tg(phox2bb:GFP)ゼブラフィッシュ系統を用いて、受精後5日(dpf)幼生の腸管分離法を1細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)解析で紹介します(図1)。
Protocol
すべてのゼブラフィッシュの飼育と実験は、エラスムスMCおよび動物福祉法の制度的ガイドラインに従って行われました。受精後5日目のゼブラフィッシュ幼生の使用は、オランダの規制で概説されているように、正式な倫理的承認を必要としない実験のカテゴリーに分類されます。 1. 受精後5日(dpf)野生型とtg(phox2bb:GFP)幼虫の獲得 野生型ゼブラ?…
Representative Results
このプロトコルにより、5 dpf 幼虫から腸全体の分離と解離に成功しました。パパインを解離酵素として使用することで、細胞の生存率が大幅に向上し、244個の単離された腸内から単一の生存細胞(全細胞の6.4%)を含む46,139個のイベントを捕捉することができました(図2A)。野生型全幼虫を対照として使用し、選別プロセスを最適化し、効果的な細胞の同定と選別を可能にし…
Discussion
ここでは、FACSを用いた5dpfゼブラフィッシュ仔魚の腸内分離・解離法について紹介する。この方法では、10x Genomics Chromium プラットフォームを使用して、scRNA-seq によるさまざまな腸細胞の収集と解析に成功しました。tg(phox2bb:GFP)ゼブラフィッシュ系統を選択したのは、生存可能なENS細胞も単離されることを示すためでした(図2D)。ただし、phox2bbゲーティングは神経?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ソフィア財団の友人(SSWO WAR-63)から資金提供を受けました。
Materials
| 10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) | Sigma | 59418C | |
| 5 mL round bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap | BD Biosciences | 352054 | |
| Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
| Dissection microscope | Olympus SZX16 | ||
| FACSAria III sorter machine | BD Biosciences | N/A | |
| HBSS with CaCl2 and MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| MS-222, Tricaine | Supelco | A5040-250G | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | Cat#T8154 |
References
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Cite This Article
Kakiailatu, N. J. M., Kuil, L. E., Bindels, E., Zink, J. T. M., Vermeulen, M., Melotte, V., Alves, M. M. Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (201), e65876, doi:10.3791/65876 (2023).