JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

Tek Hücreli RNA Dizilimi için Zebra Balığı Larvalarından Bağırsak İzolasyonu

Published: November 10, 2023
doi:
10.3791/65876
, , , , , ,
1Department of Clinical Genetics,Erasmus University Medical Center – Sophia Children’s Hospital, 2Division of Psychosocial Research and Epidemiology,the Netherlands Cancer Institute, 3Department of Hematology,Erasmus Medical Center, 4Department of Pathology, GROW-School for Oncology and Developmental Biology,Maastricht University Medical Center

Summary

Burada, tek hücreli RNA dizileme analizi için döllenmeden 5 gün sonra zebra balığı larvalarından bağırsak izolasyonu için bir yöntem açıklıyoruz.

Abstract

Gastrointestinal (GI) sistem, yaşam için gerekli olan bir dizi işlevi yerine getirir. Gelişimini etkileyen konjenital kusurlar, enterik nöromüsküler bozukluklara yol açabilir ve GI gelişimi ve disfonksiyonunun altında yatan moleküler mekanizmaları anlamanın önemini vurgular. Bu çalışmada, tek hücreli RNA dizileme (scRNA-dizilimi) analizi için kullanılabilecek canlı, canlı hücreler elde etmek için döllenmeden 5 gün sonra zebra balığı larvalarından bağırsak izolasyonu için bir yöntem sunuyoruz. Bu protokol, zebra balığı bağırsağının manuel diseksiyonuna ve ardından papain ile enzimatik ayrışmaya dayanır. Daha sonra, hücreler floresanla aktive edilen hücre sıralamasına gönderilir ve canlı hücreler scRNA dizilimi için toplanır. Bu yöntemle, epitel, stromal, kan, kas ve bağışıklık hücrelerinin yanı sıra enterik nöronlar ve glia dahil olmak üzere farklı bağırsak hücre tiplerini başarıyla tanımlayabildik. Bu nedenle, zebra balığı kullanarak sağlık ve hastalıkta GI yolunun bileşimini incelemek için değerli bir kaynak olduğunu düşünüyoruz.

Introduction

Gastrointestinal (GI) sistem, genel sağlık ve esenlikte hayati bir rol oynayan karmaşık bir sistemdir. Besinlerin sindirimi ve emiliminin yanı sıra atık ürünlerin ortadan kaldırılmasından sorumludur 1,2. GI yolu, uygun bağırsak fonksiyonunu düzenlemek ve sürdürmek için birbirine yakın iletişim kuran epitel hücreleri, düz kas hücreleri, bağışıklık hücreleri ve enterik sinir sistemi (ENS) dahil olmak üzere çoklu hücre tiplerinden oluşur 3,4,5. GI yolunun gelişimindeki kusurlar, besin emilimi, mikrobiyota bileşimi, bağırsak-beyin ekseni ve ENS gibi çeşitli yönler üzerinde geniş kapsamlı etkilere sahip olabilir ve Hirschsprung hastalığı ve Kronik bağırsak psödo-tıkanıklığı gibi çeşitli enterik nöromüsküler bozukluklara yol açabilir 6,7. Bu bozukluklar, Cajal’ın interstisyel hücreleri, düz kas hücreleri ve ENS 6,8,9 gibi çeşitli anahtar hücrelerdeki değişikliklerin neden olduğu şiddetli bağırsak dismotilitesi ile karakterizedir. Bununla birlikte, GI gelişimi ve işlev bozukluğunun altında yatan moleküler mekanizmalar hala tam olarak anlaşılamamıştır.

Zebra balığı, hızlı embriyonik gelişimi, embriyonik ve larva aşamalarındaki şeffaflığı ve genetik izlenebilirliği nedeniyle GI gelişimi ve işlev bozukluğunu incelemek için değerli bir model organizmadır 10,11,12,13,14. Floresan proteinleri eksprese eden çok sayıda transgenik zebra balığı hattı mevcuttur. Böyle bir çizginin bir örneği, enterik nöronlar da dahil olmak üzere tüm phox2bb+ hücreleri15,16 olarak etiketlendiğinden, ENS’yi incelemek için yaygın olarak kullanılan tg(phox2bb:GFP) zebra balığıdır. Burada, tg(phox2bb:GFP) zebra balığı hattını kullanarak, tek hücreli RNA dizileme (scRNA-dizilimi) analizi için döllenmeden 5 gün sonra (dpf) larvalarının bağırsak izolasyonu için bir yöntem sunuyoruz (Şekil 1).

Protocol

Tüm zebra balığı yetiştiriciliği ve deneyleri, Erasmus MC ve Hayvan refahı mevzuatının kurumsal yönergelerine göre yürütülmüştür. Zebra balığı larvalarının döllenmeden 5 gün sonra kullanılması, Hollanda yönetmeliklerinde belirtildiği gibi, resmi etik onay gerektirmeyen deneyler kategorisine girer. 1. Döllenmeden 5 gün sonra (dpf) yabani tip ve tg(phox2bb:GFP) larvalarının elde edilmesi Yabani tip zebra balığı yetiştiricili…

Representative Results

Bu protokol ile 5 dpf larvadan tüm bağırsakların başarılı bir şekilde izolasyonunu ve ayrışmasını sağladık. Papain’i ayrışma enzimi olarak kullanarak, hücre canlılığını önemli ölçüde artırdık ve 46,139 izole bağırsaktan tek, canlı hücreleri (tüm hücrelerin% 6.4’ü) içeren 244 olayın yakalanmasını sağladık (Şekil 2A). Yabani tip bütün larvalar, ayıklama işleminin optimize edilmesini sağlamak için bir kontrol olarak kullanıldı, bu da etkili hüc…

Discussion

Burada, FACS kullanarak 5 dpf zebra balığı larvasının bağırsağının izolasyonu ve ayrışması için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntemle, farklı bağırsak hücre tipleri, 10x Genomics Chromium platformu kullanılarak scRNA-seq ile başarıyla toplandı ve analiz edildi. Canlı ENS hücrelerinin de izole edileceğine dair bir gösterge istediğimiz için tg(phox2bb:GFP) zebra balığı hattını seçtik (Şekil 2D). Bununla birlikte, bu yöntemin diğer zebra balığı ilg…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Sophia Vakfı’nın (SSWO WAR-63) arkadaşları tarafından finanse edildi.

Materials

10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) Sigma 59418C
5 mL round bottom tube with cell-strainer cap Falcon 352235
Agarose Sigma-Aldrich A9539
BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap BD Biosciences 352054
Cell Ranger v3.0.2 10X Genomics N/A
DAPI Sigma-Aldrich Cat#D-9542
Dissection microscope Olympus SZX16
FACSAria III sorter machine BD Biosciences N/A
HBSS with CaCl2 and MgCl2 Gibco 14025050
Insect pins Fine Science Tools 26000-25
L-Cysteine Sigma C7352
MS-222, Tricaine Supelco A5040-250G
Papain Sigma P4762
Seurat v3 Stuart et al. (2019) N/A
Trypan blue  Sigma  Cat#T8154
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses. Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).
  2. Sitrin, M. . The Gastrointestinal System. , (2014).
  3. Furness, J. B. The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).
  4. Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).
  5. Obata, Y., Pachnis, V. The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system. Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).
  6. Heuckeroth, R. O. Hirschsprung disease – integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).
  7. Antonucci, A., et al. Chronic intestinal pseudo-obstruction. World Journal of Gastroenterology. 14 (19), 2953-2961 (2008).
  8. De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction. Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).
  9. Bianco, F., et al. Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction. Biomolecules. 12 (12), 1849 (2022).
  10. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  11. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
  12. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  13. Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).
  14. Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).
  15. Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish. Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).
  16. Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073 (2020).
  17. Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
  18. Kuil, L. E., et al. Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level. iScience. 26 (7), 107070 (2023).
  19. Gao, Y., et al. Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver. Cells. 11 (20), 3290 (2022).
  20. Jin, Q., et al. Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification. Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).
  21. Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine. Cell Reports. 38 (5), 110311 (2022).
  22. Kline, M. . Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants. , (2016).
  23. Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia. Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).
  24. Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres. Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617 (2016).

Tags

ZebrafishGut IsolationSingle-cell RNA SequencingGastrointestinal DevelopmentEnteric Nervous SystemIntestinal Cell TypesEpithelial CellsStromal CellsBlood CellsMuscle CellsImmune CellsEnteric NeuronsEnteric GliaScRNA-seqCongenital DefectsEnteric Neuromuscular DisordersGastrointestinal Health And Disease

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kakiailatu, N. J. M., Kuil, L. E., Bindels, E., Zink, J. T. M., Vermeulen, M., Melotte, V., Alves, M. M. Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (201), e65876, doi:10.3791/65876 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image