Darmisolierung aus Zebrafischlarven für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung
Summary
Hier beschreiben wir eine Methode zur Darmisolierung von Zebrafischlarven 5 Tage nach der Befruchtung für die Einzelzell-RNA-Sequenzierungsanalyse.
Abstract
Der Magen-Darm-Trakt erfüllt eine Reihe von Funktionen, die für das Leben unerlässlich sind. Angeborene Defekte, die seine Entwicklung beeinträchtigen, können zu enterischen neuromuskulären Erkrankungen führen, was unterstreicht, wie wichtig es ist, die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der Entwicklung und Dysfunktion des Magen-Darm-Trakts zugrunde liegen. In dieser Studie stellen wir eine Methode zur Darmisolierung von Zebrafischlarven 5 Tage nach der Befruchtung vor, um lebende, lebensfähige Zellen zu erhalten, die für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) verwendet werden können. Dieses Protokoll basiert auf der manuellen Dissektion des Zebrafischdarms, gefolgt von der enzymatischen Dissoziation mit Papain. Anschließend werden die Zellen einer fluoreszenzaktivierten Zellsortierung unterzogen und lebensfähige Zellen für die scRNA-Sequenzierung gesammelt. Mit dieser Methode konnten wir erfolgreich verschiedene Darmzelltypen identifizieren, darunter Epithel-, Stroma-, Blut-, Muskel- und Immunzellen sowie enterische Neuronen und Gliazellen. Daher betrachten wir es als eine wertvolle Ressource, um die Zusammensetzung des Magen-Darm-Trakts bei Gesundheit und Krankheit anhand des Zebrafisches zu untersuchen.
Introduction
Der Magen-Darm-Trakt ist ein komplexes System, das eine wichtige Rolle für die allgemeine Gesundheit und das Wohlbefinden spielt. Es ist für die Verdauung und Aufnahme von Nährstoffen sowie für die Ausscheidung von Abfallproduktenverantwortlich 1,2. Der Magen-Darm-Trakt besteht aus mehreren Zelltypen, darunter Epithelzellen, glatte Muskelzellen, Immunzellen und das enterische Nervensystem (ENS), die eng miteinander kommunizieren, um die ordnungsgemäße Darmfunktion zu regulieren und aufrechtzuerhalten 3,4,5. Defekte in der Entwicklung des Magen-Darm-Trakts können weitreichende Auswirkungen auf verschiedene Aspekte wie die Nährstoffaufnahme, die Zusammensetzung der Mikrobiota, die Darm-Hirn-Achse und das ENS haben und zu verschiedenen enterischen neuromuskulären Erkrankungen wie Morbus Hirschsprung und chronischer intestinaler Pseudoobstruktion führen 6,7. Diese Erkrankungen sind gekennzeichnet durch eine schwere Darmdysmotilität, die durch Veränderungen in verschiedenen Schlüsselzellen verursacht wird, wie z. B. den interstitiellen Zellen des Cajal, den glatten Muskelzellen und dem ENS 6,8,9. Die molekularen Mechanismen, die der Entwicklung und Dysfunktion des Magen-Darm-Trakts zugrunde liegen, sind jedoch noch wenig verstanden.
Der Zebrafisch ist aufgrund seiner schnellen Embryonalentwicklung, seiner Transparenz während des Embryonal- und Larvenstadiums und seiner genetischen Lenkbarkeit ein wertvoller Modellorganismus für die Untersuchung der Magen-Darm-Entwicklung und -Dysfunktion 10,11,12,13,14. Es stehen zahlreiche transgene Zebrafischlinien zur Verfügung, die fluoreszierende Proteine exprimieren. Ein Beispiel für eine solche Linie ist der tg(phox2bb:GFP)-Zebrafisch, der häufig zur Untersuchung des ENS verwendet wird, da alle phox2bb+-Zellen, einschließlich enterischer Neuronen, mit15,16 markiert sind. In dieser Arbeit stellen wir unter Verwendung der tg(phox2bb:GFP)-Zebrafischlinie eine Methode zur Darmisolierung von Larven nach der Befruchtung (dpf) für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq)-Analyse vor (Abbildung 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier stellen wir eine Methode zur Isolierung und Dissoziation des Darms von 5 dpf Zebrafischlarven mittels FACS vor. Mit dieser Methode wurden verschiedene Darmzelltypen erfolgreich gesammelt und mittels scRNA-seq unter Verwendung der 10x Genomics Chromium-Plattform analysiert. Wir haben uns für die tg(phox2bb:GFP)-Zebrafischlinie entschieden, da wir einen Hinweis darauf haben wollten, dass auch lebensfähige ENS-Zellen isoliert werden (Abbildung 2D). Es ist jedoch wichtig zu beach…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den Freunden der Sophia-Stiftung (SSWO WAR-63) finanziert.
Materials
| 10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) | Sigma | 59418C | |
| 5 mL round bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap | BD Biosciences | 352054 | |
| Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
| Dissection microscope | Olympus SZX16 | ||
| FACSAria III sorter machine | BD Biosciences | N/A | |
| HBSS with CaCl2 and MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| MS-222, Tricaine | Supelco | A5040-250G | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | Cat#T8154 |
References
- Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses. Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).
- Sitrin, M. . The Gastrointestinal System. , (2014).
- Furness, J. B. The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).
- Obata, Y., Pachnis, V. The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system. Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).
- Heuckeroth, R. O. Hirschsprung disease – integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).
- Antonucci, A., et al. Chronic intestinal pseudo-obstruction. World Journal of Gastroenterology. 14 (19), 2953-2961 (2008).
- De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction. Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).
- Bianco, F., et al. Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction. Biomolecules. 12 (12), 1849 (2022).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).
- Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).
- Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish. Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).
- Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073 (2020).
- Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Kuil, L. E., et al. Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level. iScience. 26 (7), 107070 (2023).
- Gao, Y., et al. Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver. Cells. 11 (20), 3290 (2022).
- Jin, Q., et al. Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification. Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).
- Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine. Cell Reports. 38 (5), 110311 (2022).
- Kline, M. . Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants. , (2016).
- Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia. Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).
- Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres. Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617 (2016).
