Ex Vivo (Canlı Canlı) Drosophila Epilepsi Modeli için Kalsiyum Görüntüleme
Summary
Burada, epileptiform aktiviteleri izlemek için GCaMP6 eksprese eden yetişkin Drosophila’da ex vivo kalsiyum görüntüleme için bir protokol sunuyoruz. Protokol, ex vivo kalsiyum görüntüleme yoluyla yetişkin Drosophila’daki iktal olayları araştırmak için değerli bir araç sağlar ve hücresel seviyelerde epilepsinin potansiyel mekanizmalarının araştırılmasına olanak tanır.
Abstract
Epilepsi, dünya çapında 70 milyondan fazla kişiyi etkileyen, kısmen genetik kökenle ilişkili, tekrarlayan nöbetlerle karakterize nörolojik bir hastalıktır. Epilepsinin klinik önemine rağmen, merkezi sinir sistemindeki nöral aktivitenin fonksiyonel analizi hala geliştirilmemiştir. Görüntüleme teknolojisindeki son gelişmeler, GCaMP6 gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerinin kararlı ekspresyonu ile birlikte, hem beyin çapında hem de tek hücreli çözünürlük seviyelerinde epilepsi çalışmalarında devrim yaratmıştır. Drosophila melanogaster, karmaşık moleküler genetiği ve davranışsal tahlilleri nedeniyle epilepsinin altında yatan moleküler ve hücresel mekanizmaları araştırmak için bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu çalışmada, GCaMP6 eksprese eden erişkin Drosophila’da epileptiform aktiviteleri izlemek için ex vivo kalsiyum görüntüleme için yeni ve etkili bir protokol sunuyoruz. Tüm beyin, iyi bilinen bir epilepsi geni olan cac’den hazırlanır, nöral aktiviteyi patlamaya duyarlı nöbet benzeri davranış testinin bir devamı olarak tanımlamak için konfokal mikroskopla kalsiyum görüntüleme için nakavt sinekleri. Cac knockdown sinekleri, vahşi tip sineklere göre daha büyük sivri uçlar ve daha az küçük sivri uçlar dahil olmak üzere daha yüksek oranda nöbet benzeri davranış ve anormal kalsiyum aktiviteleri gösterdi. Kalsiyum aktiviteleri nöbet benzeri davranışla ilişkiliydi. Bu metodoloji, epilepsi için patojenik genlerin taranmasında ve hücresel düzeyde epilepsinin potansiyel mekanizmasının araştırılmasında etkili bir metodoloji olarak hizmet eder.
Introduction
Spontan ve provoke edilmemiş nöbetlerin ve anormal nöronal ağ aktivitesinin nüksü ile karakterize karmaşık bir kronik nörolojik bozukluk olan epilepsi, dünya çapında 70 milyondan fazla kişiyi etkileyerek onu en yaygın nörolojik hastalıklardan biri haline getirmiştir1 ve ailelerin ve toplumun ağır yüklerine yol açmaktadır. Epilepsinin etkisi göz önüne alındığında, genetiği birçok epilepsi veya epileptik sendrom tipinin birincil nedeni olarak onaylanan nöbetlerin etiyolojisini belirlemek için birçok çalışma yapılmıştır2. Son on yıllarda, genomik teknolojilerdeki ilerlemeler, iyon kanalları ve iyon kanalı olmayan genlerde dahil olmak üzere nöbet oluşumunda çok önemli bir rol oynayan yeni epilepsi ile ilişkili genlerin keşfinde hızlı bir artışa yol açmıştır 3,4. Bununla birlikte, genler ve epileptik fenotipler arasındaki altta yatan mekanizmalar ve fonksiyonel analizler tam olarak anlaşılamamıştır. Epilepsi ile ilişkili genlerin ve mekanizmaların tanımlanması, hastaların etkin bir şekilde yönetilmesine olanak sağlar 5,6.
Sitozolik kalsiyum sinyalleri, nöronal aktivite ve sinaptik iletimde çok önemli unsurlardır. Beyin dilimleri7, in vivo 8,9 ve ex vivo10 dahil olmak üzere kalsiyum görüntüleme, 1970’lerden beri nöronal uyarılabilirlik için bir belirteç olarak nöronal aktiviteyi11 izlemek için kullanılmıştır12,13. Görüntüleme teknolojisindeki son gelişmeler, GCaMP6 gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI’ler) ile birlikte, hem beyin çapında hem de tek hücreli çözünürlük seviyelerinde 14,15,16 epilepsi çalışmasında devrim yaratmıştır. Sırasıyla aksiyon potansiyellerinde ve sinaptik iletimde kalsiyum konsantrasyonunda ve geçici akımlarda değişiklikler gözlenmiştir14, bu da hücre içi kalsiyum seviyelerindeki değişikliğin nöronların elektriksel uyarılabilirliği ile sıkı bir korelasyon sergilediğinigösterir 17,18. Kalsiyum görüntüleme ayrıca gelişimsel nöbet modeli9 olarak uygulanmış ve antikonvülsif bileşiklerin taranması için Drosophila’da gerçekleştirilmiştir19.
Drosophila melanogaster, sofistike moleküler genetiği ve davranışsal tahlilleri nedeniyle epilepsi gibi bilimsel araştırmalarda güçlü bir model organizma olarak ortaya çıkmaktadır 20,21,22. Ayrıca, Drosophila’daki gelişmiş genetik araçlar, genetik olarak kodlanmış kalsiyum indikatörü GCaMP6’nın ekspresyonuna katkıda bulunmuştur. Örneğin, Gal4 ve UAS tabanlı ikili transkripsiyonel sistemler, GCaMP6’nın uzamsal ve zamansal olarak kontrollü bir şekilde spesifik ekspresyonunu sağlar. Drosophila küçük bir organizma olduğundan, in vivo kalsiyum görüntüleme, beynin dorsalinin sadece küçük bir kısmının küçük bir pencereden açığa çıktığı cerrahi bir müdahaleyi gerçekleştirmek için yetkin operasyon becerileri gerektirir14,23. Aynı zamanda, Drosophila’nın sağlam beynindeki ex vivo kalsiyum görüntüleme, tüm beynin ilgilenilen bölgelerini (ROI’ler) izlemek için kullanılabilir.
Bu çalışmada, GCaMP6 eksprese eden erişkin Drosophila’da epileptiform aktiviteleri izlemek için ex vivo kalsiyum görüntüleme sunuldu. CACNA1A iyi bilinen bir epilepsi geni olan cac, CACNA1A için bir homolog olan Cav2 kanalına aittir. Cac knockdown sineklerinin beyinlerini tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi’yi inceleyerek ve bunları xyt tarama modlu bir konfokal mikroskop kullanarak görüntüleyerek başladık. Daha sonra, %ΔF/F değeri ve GCaMP6 floresansının kalsiyum olayları gibi spontan nöbet benzeri olayları ölçen göstergeleri hesaplayarak ROI’lerin kalsiyum sinyallerindeki değişiklikleri analiz ettik. Ek olarak, kalsiyum görüntüleme sonuçlarını doğrulamak için cac-knockdown sinekleri üzerinde nöbet davranışı testlerini indüklemek için vorteks makinesi ile mekanik uyaran gerçekleştirdik. Genel olarak, bu protokol, ex vivo kalsiyum görüntüleme yoluyla yetişkin Drosophila’daki iktal olayları araştırmak için değerli bir araç sağlar ve hücresel seviyelerde epilepsinin potansiyel mekanizmalarının araştırılmasına izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kalsiyum iyonu, hem kimyasal hem de elektriksel bozulmalara karşı bir dizi fizyolojik ve patofizyolojik yanıtta çok önemli bir rol oynayan çok önemli bir ikinci haberci olarak hizmet eder. Ayrıca, insan CACNA1A geni tarafından kodlanan presinaptik P/Q kanallarının topolojik elemanının, glutamat30,31,32 dahil olmak üzere çeşitli nörotransmiterlerin deşarjına aracılık etmekten sorumlu olduğu ve epile…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Guangdong Temel ve Uygulamalı Temel Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir (hibe no. 2022A1515111123 Jing-Da Qiao’ya) ve GMU’daki (Jing-Da Qiao) bilimsel araştırmaları geliştirmeyi planlamaktadır. Bu çalışma aynı zamanda Guangzhou Tıp Üniversitesi Öğrenci İnovasyon Yeteneği Enihancement Planı (Finansman No. 02-408-2304-02038XM) tarafından da desteklenmiştir.
Materials
| Brushes | Panera | AAhc022-2 | for handling flies |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Confocal microscope | SP8; Zeiss, Jena, Germany. | N/A | for calcium imaging |
| CO2 anesthesia machine | N/A | N/A | for Anesthetizing the flies. |
| C-sharp holder | N/A | N/A | handmade, for mounting the brain |
| Culture vials | Biologix | 51-0500 | 2.5 cm diameter, 9.5 cm height |
| Fiji software | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | version: 2.14.0 | for analysis |
| Fly morgue | N/A | N/A | handmade, for handling flies |
| Fly stocks | cac-RNAi | 27244 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | GCaMP6m | 42750 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | tub-Gal4 | N/A | from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| High-resolution camera | N/A | N/A | for recording the seizure-like behavior assay |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Papain suspension | Worthington Biochemical | LS003126 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | SLW1480/02D | for dissection |
| Pipette | Thermo Scientific | 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 | for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Recording dish | Thermo Scientific | 150682- Glass Based Dish | for holding the brain and calcium imaging |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S25550 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| Stereo-binocular microscope | SHANG GUANG | XTZ-D | for handling flies and dissection |
| Syringe needles | pythonbio | HCL0693 | for dissection |
| Tripod | WEIFENG | 45634732523 | for recording the seizure-like behavior assay |
| Vortex mixer | Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich | Z653438 | for performing the seizure-like behavior assay |
| Whiteboard | N/A | N/A | handmade, foam pad or paper for background |
References
- Thijs, R. D., Surges, R., O’brien, T. J., Sander, J. W. Epilepsy in adults. Lancet. 393 (10172), 689-701 (2019).
- Ellis, C. A., Petrovski, S., Berkovic, S. F. Epilepsy genetics: Clinical impacts and biological insights. Lancet Neurol. 19 (1), 93-100 (2020).
- Wang, J., et al. Epilepsy-associated genes. Seizure. 44, 11-20 (2017).
- Oliver, K. L., et al. Genes4epilepsy: An epilepsy gene resource. Epilepsia. 64 (5), 1368-1375 (2023).
- Rogawski, M. A., Loscher, W., Rho, J. M. Mechanisms of action of antiseizure drugs and the ketogenic diet. Cold Spring Harb Perspect Med. 6 (5), 022780 (2016).
- Ademuwagun, I. A., Rotimi, S. O., Syrbe, S., Ajamma, Y. U., Adebiyi, E. Voltage gated sodium channel genes in epilepsy: Mutations, functional studies, and treatment dimensions. Front Neurol. 12, 600050 (2021).
- Leweke, F. M., Louvel, J., Rausche, G., Heinemann, U. Effects of pentetrazol on neuronal activity and on extracellular calcium concentration in rat hippocampal slices. Epilepsy Res. 6 (3), 187-198 (1990).
- Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nat Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
- Hewapathirane, D. S., Dunfield, D., Yen, W., Chen, S., Haas, K. In vivo imaging of seizure activity in a novel developmental seizure model. Exp Neurol. 211 (2), 480-488 (2008).
- Ishimoto, H., Sano, H. Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila. J Vis Exp. 136, 57701 (2018).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Moisescu, D. G., Ashley, C. C., Campbell, A. K. Comparative aspects of the calcium-sensitive photoproteins aequorin and obelin. Biochim Biophys Acta. 396 (1), 133-140 (1975).
- Blinks, J. R., Prendergast, F. G., Allen, D. G. Photoproteins as biological calcium indicators. Pharmacol Rev. 28 (1), 1-93 (1976).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved gcamp calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
- Rochefort, N. L., Jia, H., Konnerth, A. Calcium imaging in the living brain: Prospects for molecular medicine. Trends Mol Med. 14 (9), 389-399 (2008).
- Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. Br J Pharmacol. 163 (8), 1605-1625 (2011).
- Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59 (6), 861-872 (2008).
- Streit, A. K., Fan, Y. N., Masullo, L., Baines, R. A. Calcium imaging of neuronal activity in drosophila can identify anticonvulsive compounds. PLoS One. 11 (2), 0148461 (2016).
- Parker, L., Howlett, I. C., Rusan, Z. M., Tanouye, M. A. Seizure and epilepsy: Studies of seizure disorders in drosophila. Int Rev Neurobiol. 99, 1-21 (2011).
- Del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in drosophila. Nat Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
- Liu, C. Q., et al. Efficient strategies based on behavioral and electrophysiological methods for epilepsy-related gene screening in the drosophila model. Front Mol Neurosci. 16, 1121877 (2023).
- Wang, Y., et al. Genetic manipulation of the odor-evoked distributed neural activity in the drosophila mushroom body. Neuron. 29 (1), 267-276 (2001).
- Wang, J., et al. Unc13b variants associated with partial epilepsy with favourable outcome. Brain. 144 (10), 3050-3060 (2021).
- Ganetzky, B., Wu, C. F. Indirect suppression involving behavioral mutants with altered nerve excitability in drosophila melanogaster. Genetics. 100 (4), 597-614 (1982).
- Roemmich, A. J., Schutte, S. S., O’dowd, D. K. Ex vivo whole-cell recordings in adult drosophila brain. Bio Protoc. 8 (14), 2467 (2018).
- Gu, H., O’dowd, D. K. Whole cell recordings from brain of adult drosophila. J Vis Exp. (6), 248 (2007).
- Qiao, J., Yang, S., Geng, H., Yung, W. H., Ke, Y. Input-timing-dependent plasticity at incoming synapses of the mushroom body facilitates olfactory learning in drosophila. Curr Biol. 32 (22), 4869-4880 (2022).
- Liu, C. -. Q., Lin, Y. -. M., Zhang, X. -. X., Peng, R. -. C., Qiao, J. -. D. Protective effect of CACNA1A deficiency against seizure in the CACNA1A-CELSR2 digenic knockdown flies. Research Square. , (2023).
- Uchitel, O. D., Inchauspe, C. G., Urbano, F. J. D. i., Guilmi, M. N. Cav2.1 voltage activated calcium channels and synaptic transmission in familial hemiplegic migraine pathogenesis. J Physiol Paris. 106 (1-2), 12-22 (2012).
- Le Roux, M., et al. Cacna1a-associated epilepsy: Electroclinical findings and treatment response on seizures in 18 patients. Eur J Paediatr Neurol. 33, 75-85 (2021).
- Alehabib, E., et al. Clinical and molecular spectrum of p/q type calcium channel cav2.1 in epileptic patients. Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 461 (2021).
- Li, X. L., et al. Cacna1a mutations associated with epilepsies and their molecular sub-regional implications. Front Mol Neurosci. 15, 860662 (2022).
- Indelicato, E., Boesch, S. From genotype to phenotype: Expanding the clinical spectrum of cacna1a variants in the era of next generation sequencing. Front Neurol. 12, 639994 (2021).
- Saras, A., Tanouye, M. A. Mutations of the calcium channel gene cacophony suppress seizures in drosophila. Plos Genetics. 12 (1), e1005784 (2016).
- Cozzolino, O., et al. Evolution of epileptiform activity in zebrafish by statistical-based integration of electrophysiology and 2-photon ca2+ imaging. Cells. 9 (3), 769 (2020).
- Mituzaite, J., Petersen, R., Claridge-Chang, A., Baines, R. A. Characterization of seizure induction methods in drosophila. eNeuro. 8 (4), (2021).
- Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S. The joy of balancers. Plos Genetics. 15 (11), e1008421 (2019).
