Ex Vivo Imaging del calcio per il modello di epilessia di Drosophila

L’epilessia, una complessa malattia neurologica cronica caratterizzata dalla ricorrenza di convulsioni spontanee e non provocate e da un’attività aberrante della rete neuronale, ha colpito oltre 70 milioni di persone in tutto il mondo, rendendola una^{delle malattie} neurologiche più comuni e portando ai pesanti fardelli delle famiglie e della società. In considerazione dell’impatto dell’epilessia, sono stati condotti molti studi per identificare l’eziologia delle convulsioni, di cui la genetica è stata approvata come causa primaria di molti tipi di epilessie o sindromi epilettiche². Negli ultimi decenni, i progressi nelle tecnologie genomiche hanno portato a un rapido aumento della scoperta di nuovi geni associati all’epilessia, che svolgono un ruolo cruciale nell’insorgenza delle crisi, compresi i canali ionici e i geni dei canali non ionici ^3,4. Tuttavia, i meccanismi sottostanti e l’analisi funzionale tra i geni e i fenotipi epilettici non sono completamente compresi. L’identificazione dei geni e dei meccanismi associati all’epilessia offre la possibilità di gestire i pazienti in modo efficiente ^5,6.

I segnali citosolici del calcio sono elementi fondamentali nell’attività neuronale e nella trasmissione sinaptica. L’imaging del calcio, comprese le fette cerebrali⁷, in vivo ^8,9 e ex vivo¹⁰, è stato utilizzato per monitorare l’attività neuronale¹¹ come marcatore per l’eccitabilità neuronale dal 1970^12,13. I recenti progressi nella tecnologia di imaging, in combinazione con gli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI), come GCaMP6, hanno rivoluzionato lo studio dell’epilessia sia a livello cerebrale che a livello di singola cellula 14,15,16, che ha un alto livello di precisione spazio-temporale. Cambiamenti nella concentrazione di calcio e nei transienti sono stati osservati rispettivamente nei potenziali d’azione e nella trasmissione sinaptica¹⁴, indicando che l’alterazione dei livelli intracellulari di calcio mostra una stretta correlazione con l’eccitabilità elettrica dei neuroni ^17,18. L’imaging del calcio è stato anche applicato come modello di convulsione^{dello sviluppo 9} ed eseguito in Drosophila per lo screening di composti anticonvulsivanti¹⁹.

La Drosophila melanogaster sta emergendo come un potente organismo modello nella ricerca scientifica, come l’epilessia, per la sua sofisticata genetica molecolare e i saggi comportamentali 20,21,22. Inoltre, gli strumenti genetici avanzati di Drosophila hanno contribuito all’espressione dell’indicatore di calcio codificato geneticamente GCaMP6. Ad esempio, i sistemi trascrizionali binari basati su Gal4 e UAS consentono un’espressione specifica del GCaMP6 in modo spazialmente e temporalmente controllato. Poiché la Drosophila è un organismo minuscolo, l’imaging del calcio in vivo richiede competenze operative competenti per eseguire un intervento chirurgico, in cui solo una piccola parte della dorsale del cervello è stata esposta attraverso una piccola finestra^14,23. Allo stesso tempo, l’imaging del calcio ex vivo nel cervello intatto di Drosophila può essere utilizzato per monitorare le regioni di interesse (ROI) dell’intero cervello.

In questo studio, presentiamo l’imaging del calcio ex vivo in Drosophila adulta esprimente GCaMP6 per monitorare le attività epilettiformi. CACNA1A è un noto gene dell’epilessia, il cac appartiene al canale Cav2, che è un omologo di CACNA1A. Abbiamo iniziato sezionando il cervello dei moscerini knockdown cac tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi e impersonandoli utilizzando un microscopio confocale con modalità di scansione xyt. Abbiamo quindi analizzato i cambiamenti nei segnali di calcio delle ROI calcolando indicatori che quantificano gli eventi spontanei simili alle convulsioni, come il valore %ΔF/F e gli eventi di calcio della fluorescenza GCaMP6. Inoltre, abbiamo eseguito uno stimolo meccanico con una macchina a vortice per indurre test di comportamento convulsivo su mosche cac-knockdown e per convalidare i risultati dell’imaging del calcio. Nel complesso, questo protocollo fornisce uno strumento prezioso per studiare gli eventi ictali nella Drosophila adulta attraverso l’imaging del calcio ex vivo , consentendo l’esplorazione dei potenziali meccanismi dell’epilessia a livello cellulare.