Ex Vivo Imágenes de calcio para el modelo de epilepsia de Drosophila
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la obtención de imágenes de calcio ex vivo en Drosophila adulta que expresa GCaMP6 para monitorear las actividades epileptiformes. El protocolo proporciona una herramienta valiosa para investigar eventos ictales en Drosophila adulta a través de imágenes de calcio ex vivo , lo que permite explorar los posibles mecanismos de la epilepsia a nivel celular.
Abstract
La epilepsia es un trastorno neurológico caracterizado por convulsiones recurrentes, parcialmente correlacionadas con el origen genético, que afecta a más de 70 millones de personas en todo el mundo. A pesar de la importancia clínica de la epilepsia, el análisis funcional de la actividad neuronal en el sistema nervioso central aún está por desarrollar. Los avances recientes en la tecnología de imágenes, en combinación con la expresión estable de indicadores de calcio codificados genéticamente, como GCaMP6, han revolucionado el estudio de la epilepsia tanto a nivel de resolución cerebral como de una sola célula. Drosophila melanogaster se ha convertido en una herramienta para investigar los mecanismos moleculares y celulares que subyacen a la epilepsia debido a su sofisticada genética molecular y ensayos conductuales. En este estudio, presentamos un protocolo novedoso y eficiente para la obtención de imágenes de calcio ex vivo en Drosophila adulta que expresa GCaMP6 para monitorear las actividades epileptiformes. Todo el cerebro se prepara a partir de cac, un gen bien conocido de la epilepsia, para obtener imágenes de calcio con un microscopio confocal para identificar la actividad neuronal como seguimiento del ensayo de comportamiento similar a las convulsiones sensible a la explosión. Las moscas de derribo de cac mostraron una tasa más alta de comportamiento similar a las convulsiones y actividades anormales de calcio, incluyendo más picos grandes y menos picos pequeños que las moscas de tipo salvaje. Las actividades de calcio se correlacionaron con un comportamiento similar a las convulsiones. Esta metodología sirve como una metodología eficiente en la detección de los genes patógenos de la epilepsia y en la exploración del mecanismo potencial de la epilepsia a nivel celular.
Introduction
La epilepsia, un trastorno neurológico crónico complejo caracterizado por la recurrencia de convulsiones espontáneas y no provocadas y una actividad aberrante de la red neuronal, ha afectado a más de 70 millones de personas en todo el mundo, lo que la convierte en una de las enfermedades neurológicas más comunes1 y conlleva una pesada carga para las familias y la sociedad. Teniendo en cuenta el impacto de la epilepsia, se han realizado muchos estudios para identificar la etiología de las convulsiones, de las cuales la genética ha sido aprobada como causa primaria de muchos tipos de epilepsias o síndromes epilépticos2. Durante las últimas décadas, los avances en las tecnologías genómicas han llevado a un rápido aumento en el descubrimiento de nuevos genes asociados a la epilepsia, que desempeñan un papel crucial en la aparición de convulsiones, incluidos los canales iónicos y los genes sin canales iónicos 3,4. Sin embargo, los mecanismos subyacentes y el análisis funcional entre los genes y los fenotipos epilépticos no se comprenden completamente. La identificación de genes y mecanismos asociados a la epilepsia ofrece la posibilidad de manejar a los pacientes de manera eficiente 5,6.
Las señales citosólicas de calcio son elementos fundamentales en la actividad neuronal y la transmisión sináptica. Las imágenes de calcio, incluyendo cortes cerebrales7, in vivo 8,9 y ex vivo10, se han utilizado para monitorear la actividad neuronal11 como marcador de excitabilidad neuronal desde la década de 1970 12,13. Los avances recientes en la tecnología de imagen, en combinación con los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI), como GCaMP6, han revolucionado el estudio de la epilepsia tanto a nivel de resolución cerebral como de resolución de una sola célula 14,15,16, que tiene un alto nivel de precisión espacio-temporal. Se observaron cambios en la concentración de calcio y transitorios en los potenciales de acción y transmisión sináptica, respectivamente14, lo que indica que la alteración de los niveles de calcio intracelular exhibe una estricta correlación con la excitabilidad eléctrica de las neuronas17,18. Las imágenes de calcio también se han aplicado como modelo de crisis del desarrollo9 y se han realizado en Drosophila para el cribado de compuestos anticonvulsivos19.
Drosophila melanogaster ha emergido como un poderoso organismo modelo en la investigación científica, como la epilepsia, por su sofisticada genética molecular y ensayos conductuales 20,21,22. Además, las herramientas genéticas avanzadas en Drosophila han contribuido a la expresión del indicador de calcio codificado genéticamente GCaMP6. Por ejemplo, los sistemas transcripcionales binarios basados en Gal4 y UAS permiten la expresión específica de GCaMP6 de una manera controlada espacial y temporalmente. Dado que Drosophila es un organismo diminuto, la obtención de imágenes de calcio in vivo requiere habilidades operativas competentes para realizar una intervención quirúrgica, en la que solo una pequeña parte de la parte dorsal del cerebro fue expuesta a través de una pequeña ventana14,23. Al mismo tiempo, las imágenes de calcio ex vivo en el cerebro intacto de Drosophila se pueden utilizar para monitorear las regiones de interés (ROI) de todo el cerebro.
En este estudio, presentamos imágenes de calcio ex vivo en Drosophila adulta que expresa GCaMP6 para monitorear las actividades epileptiformes. CACNA1A es un gen bien conocido de la epilepsia, el cac pertenece al canal Cav2, que es un homólogo de CACNA1A. Comenzamos diseccionando los cerebros de moscas cac knockdown tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi y obteniendo imágenes de ellos utilizando un microscopio confocal con modo de barrido xyt. A continuación, analizamos los cambios en las señales de calcio de los ROI mediante el cálculo de indicadores que cuantifican los eventos espontáneos similares a las convulsiones, como el valor de %ΔF/F y los eventos de calcio de la fluorescencia de GCaMP6. Además, realizamos un estímulo mecánico mediante una máquina de vórtice para inducir pruebas de comportamiento convulsivo en moscas de derribo de cac para validar los resultados de las imágenes de calcio. En general, este protocolo proporciona una herramienta valiosa para investigar eventos ictales en Drosophila adulta a través de imágenes de calcio ex vivo , lo que permite explorar los posibles mecanismos de la epilepsia a nivel celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
El ion calcio sirve como un segundo mensajero crucial, desempeñando un papel fundamental en una serie de respuestas fisiológicas y fisiopatológicas a las perturbaciones químicas y eléctricas. Además, el elemento topológico de los canales presinápticos P/Q, codificado por el gen CACNA1A humano, ha sido identificado como responsable de mediar la descarga de varios neurotransmisores, incluido el glutamato 30,31,32, y está estrechamente relacionado con la <sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación de Investigación Básica y Básica Aplicada de Guangdong (subvención n.º 2022A1515111123 a Jing-Da Qiao) y tiene previsto mejorar la investigación científica en la GMU (Jing-Da Qiao). Este trabajo también contó con el apoyo del Plan de Mejora de la Capacidad de Innovación de los Estudiantes de la Universidad de Medicina de Guangzhou (Financiación No. 02-408-2304-02038XM).
Materials
| Brushes | Panera | AAhc022-2 | for handling flies |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Confocal microscope | SP8; Zeiss, Jena, Germany. | N/A | for calcium imaging |
| CO2 anesthesia machine | N/A | N/A | for Anesthetizing the flies. |
| C-sharp holder | N/A | N/A | handmade, for mounting the brain |
| Culture vials | Biologix | 51-0500 | 2.5 cm diameter, 9.5 cm height |
| Fiji software | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | version: 2.14.0 | for analysis |
| Fly morgue | N/A | N/A | handmade, for handling flies |
| Fly stocks | cac-RNAi | 27244 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | GCaMP6m | 42750 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | tub-Gal4 | N/A | from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| High-resolution camera | N/A | N/A | for recording the seizure-like behavior assay |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Papain suspension | Worthington Biochemical | LS003126 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | SLW1480/02D | for dissection |
| Pipette | Thermo Scientific | 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 | for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Recording dish | Thermo Scientific | 150682- Glass Based Dish | for holding the brain and calcium imaging |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S25550 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| Stereo-binocular microscope | SHANG GUANG | XTZ-D | for handling flies and dissection |
| Syringe needles | pythonbio | HCL0693 | for dissection |
| Tripod | WEIFENG | 45634732523 | for recording the seizure-like behavior assay |
| Vortex mixer | Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich | Z653438 | for performing the seizure-like behavior assay |
| Whiteboard | N/A | N/A | handmade, foam pad or paper for background |
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