إكس فيفو تصوير الكالسيوم لنموذج ذبابة الفاكهة للصرع
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لتصوير الكالسيوم خارج الجسم الحي في ذبابة الفاكهة البالغة التي تعبر عن GCaMP6 لمراقبة أنشطة الصرع. يوفر البروتوكول أداة قيمة للتحقيق في أحداث ictal في ذبابة الفاكهة للبالغين من خلال تصوير الكالسيوم خارج الجسم الحي ، مما يسمح باستكشاف الآليات المحتملة للصرع على المستويات الخلوية.
Abstract
الصرع هو اضطراب عصبي يتميز بنوبات متكررة ، ترتبط جزئيا بالأصل الجيني ، وتؤثر على أكثر من 70 مليون فرد في جميع أنحاء العالم. على الرغم من الأهمية السريرية للصرع ، لا يزال يتعين تطوير التحليل الوظيفي للنشاط العصبي في الجهاز العصبي المركزي. أحدثت التطورات الحديثة في تكنولوجيا التصوير ، جنبا إلى جنب مع التعبير المستقر لمؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا ، مثل GCaMP6 ، ثورة في دراسة الصرع على مستوى الدماغ ومستويات دقة الخلية الواحدة. برزت ذبابة الفاكهة الميلانية كأداة للتحقيق في الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء الصرع بسبب علم الوراثة الجزيئي المتطور والمقايسات السلوكية. في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكولا جديدا وفعالا لتصوير الكالسيوم خارج الجسم الحي في ذبابة الفاكهة البالغة التي تعبر عن GCaMP6 لمراقبة أنشطة الصرع. يتم تحضير الدماغ كله من CAC ، وهو جين صرع معروف ، يطير ضربة قاضية لتصوير الكالسيوم باستخدام مجهر متحد البؤر لتحديد النشاط العصبي كمتابعة لفحص السلوك الشبيه بالنوبات الحساسة للانفجار. أظهر ذباب ضربة قاضية CAC معدلا أعلى من السلوك الشبيه بالنوبات وأنشطة الكالسيوم غير الطبيعية ، بما في ذلك المزيد من المسامير الكبيرة وعدد أقل من المسامير الصغيرة مقارنة بالذباب البري. ارتبطت أنشطة الكالسيوم بالسلوك الشبيه بالنوبات. تعمل هذه المنهجية كمنهجية فعالة في فحص الجينات المسببة للأمراض للصرع واستكشاف الآلية المحتملة للصرع على المستوى الخلوي.
Introduction
الصرع ، وهو اضطراب عصبي مزمن معقد يتميز بتكرار النوبات التلقائية وغير المبررة ونشاط الشبكة العصبية الشاذ ، أثر على أكثر من 70 مليون فرد في جميع أنحاء العالم ، مما يجعله أحد أكثر الأمراض العصبية شيوعا1 ويؤدي إلى أعباء ثقيلة على الأسر والمجتمع. بالنظر إلى تأثير الصرع ، أجريت العديد من الدراسات لتحديد مسببات النوبات ، والتي تمت الموافقة على علم الوراثة كسبب رئيسي للعديد من أنواع الصرع أو متلازمات الصرع2. على مدى العقود الماضية ، أدى التقدم في التقنيات الجينومية إلى زيادة سريعة في اكتشاف الجينات الجديدة المرتبطة بالصرع ، والتي تلعب دورا حاسما في حدوث النوبات ، بما في ذلك القنوات الأيونية وجينات القناة غير الأيونية 3,4. ومع ذلك ، فإن الآليات الأساسية والتحليل الوظيفي بين الجينات والأنماط الظاهرية للصرع غير مفهومة بشكل كامل. يوفر تحديد الجينات والآليات المرتبطة بالصرع إمكانية إدارة المرضى بكفاءة 5,6.
إشارات الكالسيوم الخلوية هي عناصر محورية في النشاط العصبي والانتقال المشبكي. تم استخدام تصوير الكالسيوم ، بما في ذلك شرائح الدماغ7 ، في الجسم الحي 8,9 ، و ex vivo10 ، لمراقبة النشاط العصبي11 كعلامة على استثارة الخلايا العصبية منذ سبعينيات القرن العشرين12,13. أحدثت التطورات الحديثة في تكنولوجيا التصوير ، جنبا إلى جنب مع مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) ، مثل GCaMP6 ، ثورة في دراسة الصرع على مستوى الدماغ ومستويات دقة الخليةالواحدة 14،15،16 ، والتي تتمتع بمستوى عال من الدقة الزمانية المكانية. لوحظت تغيرات في تركيز الكالسيوم والعابرين في إمكانات العمل والانتقال المشبكي ، على التوالي14 ، مما يشير إلى أن تغيير مستويات الكالسيوم داخل الخلايا يظهر علاقة صارمة مع الإثارة الكهربائية للخلايا العصبية17,18. كما تم تطبيق تصوير الكالسيوم كنموذج نوبة تنموية9 وتم إجراؤه في ذبابة الفاكهة لفحص المركبات المضادة للاختلاج19.
ظهرت ذبابة الفاكهة الميلانية ككائن نموذجي قوي في البحث العلمي ، مثل الصرع ، لعلم الوراثة الجزيئي المتطور والمقايسات السلوكية20،21،22. علاوة على ذلك ، ساهمت الأدوات الجينية المتقدمة في ذبابة الفاكهة في التعبير عن مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا GCaMP6. على سبيل المثال ، تتيح أنظمة النسخ الثنائية القائمة على Gal4 و UAS تعبيرا محددا عن GCaMP6 بطريقة يتم التحكم فيها مكانيا وزمانيا. نظرا لأن ذبابة الفاكهة هي كائن حي صغير ، فإن تصوير الكالسيوم في الجسم الحي يتطلب مهارات تشغيل بارعة لإجراء تدخل جراحي ، حيث تم تعريض جزء صغير فقط من الظهر للدماغ من خلال نافذة صغيرة14,23. في الوقت نفسه ، يمكن استخدام تصوير الكالسيوم خارج الجسم الحي في الدماغ السليم لذبابة الفاكهة لمراقبة مناطق الاهتمام (ROIs) في الدماغ بأكمله.
في هذه الدراسة ، نقدم تصوير الكالسيوم خارج الجسم الحي في ذبابة الفاكهة البالغة التي تعبر عن GCaMP6 لمراقبة أنشطة الصرع. CACNA1A هو جين صرع معروف ، ينتمي CAC إلى قناة Cav2 ، وهو متماثل مع CACNA1A. بدأنا بتشريح أدمغة ذباب ضربة قاضية من CAC-Gal4 > GCaMP6m / cac-RNAi وتصويرها باستخدام مجهر متحد البؤر مع وضع المسح xyt. ثم قمنا بتحليل التغيرات في إشارات الكالسيوم لعائد الاستثمار عن طريق حساب المؤشرات التي تحدد الأحداث الشبيهة بالنوبات التلقائية ، مثل قيمة ٪ ΔF / F وأحداث الكالسيوم لتألق GCaMP6. بالإضافة إلى ذلك ، أجرينا محفزا ميكانيكيا بواسطة آلة دوامة للحث على اختبارات سلوك النوبات على ذباب ضربة قاضية للكاك وكذلك للتحقق من صحة نتائج تصوير الكالسيوم. بشكل عام ، يوفر هذا البروتوكول أداة قيمة للتحقيق في أحداث ictal في ذبابة الفاكهة البالغة من خلال تصوير الكالسيوم خارج الجسم الحي ، مما يسمح باستكشاف الآليات المحتملة للصرع على المستويات الخلوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعمل أيون الكالسيوم كرسول ثان حاسم ، حيث يلعب دورا محوريا في مجموعة من الاستجابات الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية لكل من الاضطرابات الكيميائية والكهربائية. علاوة على ذلك ، تم تحديد العنصر الطوبولوجي لقنوات P / Q قبل المشبكي ، المشفرة بواسطة جين CACNA1A البشري ، على أنها مسؤولة عن التوس…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة قوانغدونغ للبحوث الأساسية والتطبيقية (منحة رقم 2022A1515111123 إلى Jing-Da Qiao) وخطة لتعزيز البحث العلمي في GMU (Jing-Da Qiao). تم دعم هذا العمل أيضا من قبل خطة Enihancement لقدرة الابتكار لطلاب جامعة قوانغتشو الطبية (التمويل رقم 02-408-2304-02038XM).
Materials
| Brushes | Panera | AAhc022-2 | for handling flies |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Confocal microscope | SP8; Zeiss, Jena, Germany. | N/A | for calcium imaging |
| CO2 anesthesia machine | N/A | N/A | for Anesthetizing the flies. |
| C-sharp holder | N/A | N/A | handmade, for mounting the brain |
| Culture vials | Biologix | 51-0500 | 2.5 cm diameter, 9.5 cm height |
| Fiji software | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | version: 2.14.0 | for analysis |
| Fly morgue | N/A | N/A | handmade, for handling flies |
| Fly stocks | cac-RNAi | 27244 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | GCaMP6m | 42750 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | tub-Gal4 | N/A | from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| High-resolution camera | N/A | N/A | for recording the seizure-like behavior assay |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Papain suspension | Worthington Biochemical | LS003126 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | SLW1480/02D | for dissection |
| Pipette | Thermo Scientific | 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 | for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Recording dish | Thermo Scientific | 150682- Glass Based Dish | for holding the brain and calcium imaging |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S25550 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| Stereo-binocular microscope | SHANG GUANG | XTZ-D | for handling flies and dissection |
| Syringe needles | pythonbio | HCL0693 | for dissection |
| Tripod | WEIFENG | 45634732523 | for recording the seizure-like behavior assay |
| Vortex mixer | Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich | Z653438 | for performing the seizure-like behavior assay |
| Whiteboard | N/A | N/A | handmade, foam pad or paper for background |
References
- Thijs, R. D., Surges, R., O’brien, T. J., Sander, J. W. Epilepsy in adults. Lancet. 393 (10172), 689-701 (2019).
- Ellis, C. A., Petrovski, S., Berkovic, S. F. Epilepsy genetics: Clinical impacts and biological insights. Lancet Neurol. 19 (1), 93-100 (2020).
- Wang, J., et al. Epilepsy-associated genes. Seizure. 44, 11-20 (2017).
- Oliver, K. L., et al. Genes4epilepsy: An epilepsy gene resource. Epilepsia. 64 (5), 1368-1375 (2023).
- Rogawski, M. A., Loscher, W., Rho, J. M. Mechanisms of action of antiseizure drugs and the ketogenic diet. Cold Spring Harb Perspect Med. 6 (5), 022780 (2016).
- Ademuwagun, I. A., Rotimi, S. O., Syrbe, S., Ajamma, Y. U., Adebiyi, E. Voltage gated sodium channel genes in epilepsy: Mutations, functional studies, and treatment dimensions. Front Neurol. 12, 600050 (2021).
- Leweke, F. M., Louvel, J., Rausche, G., Heinemann, U. Effects of pentetrazol on neuronal activity and on extracellular calcium concentration in rat hippocampal slices. Epilepsy Res. 6 (3), 187-198 (1990).
- Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nat Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
- Hewapathirane, D. S., Dunfield, D., Yen, W., Chen, S., Haas, K. In vivo imaging of seizure activity in a novel developmental seizure model. Exp Neurol. 211 (2), 480-488 (2008).
- Ishimoto, H., Sano, H. Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila. J Vis Exp. 136, 57701 (2018).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Moisescu, D. G., Ashley, C. C., Campbell, A. K. Comparative aspects of the calcium-sensitive photoproteins aequorin and obelin. Biochim Biophys Acta. 396 (1), 133-140 (1975).
- Blinks, J. R., Prendergast, F. G., Allen, D. G. Photoproteins as biological calcium indicators. Pharmacol Rev. 28 (1), 1-93 (1976).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved gcamp calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
- Rochefort, N. L., Jia, H., Konnerth, A. Calcium imaging in the living brain: Prospects for molecular medicine. Trends Mol Med. 14 (9), 389-399 (2008).
- Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. Br J Pharmacol. 163 (8), 1605-1625 (2011).
- Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59 (6), 861-872 (2008).
- Streit, A. K., Fan, Y. N., Masullo, L., Baines, R. A. Calcium imaging of neuronal activity in drosophila can identify anticonvulsive compounds. PLoS One. 11 (2), 0148461 (2016).
- Parker, L., Howlett, I. C., Rusan, Z. M., Tanouye, M. A. Seizure and epilepsy: Studies of seizure disorders in drosophila. Int Rev Neurobiol. 99, 1-21 (2011).
- Del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in drosophila. Nat Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
- Liu, C. Q., et al. Efficient strategies based on behavioral and electrophysiological methods for epilepsy-related gene screening in the drosophila model. Front Mol Neurosci. 16, 1121877 (2023).
- Wang, Y., et al. Genetic manipulation of the odor-evoked distributed neural activity in the drosophila mushroom body. Neuron. 29 (1), 267-276 (2001).
- Wang, J., et al. Unc13b variants associated with partial epilepsy with favourable outcome. Brain. 144 (10), 3050-3060 (2021).
- Ganetzky, B., Wu, C. F. Indirect suppression involving behavioral mutants with altered nerve excitability in drosophila melanogaster. Genetics. 100 (4), 597-614 (1982).
- Roemmich, A. J., Schutte, S. S., O’dowd, D. K. Ex vivo whole-cell recordings in adult drosophila brain. Bio Protoc. 8 (14), 2467 (2018).
- Gu, H., O’dowd, D. K. Whole cell recordings from brain of adult drosophila. J Vis Exp. (6), 248 (2007).
- Qiao, J., Yang, S., Geng, H., Yung, W. H., Ke, Y. Input-timing-dependent plasticity at incoming synapses of the mushroom body facilitates olfactory learning in drosophila. Curr Biol. 32 (22), 4869-4880 (2022).
- Liu, C. -. Q., Lin, Y. -. M., Zhang, X. -. X., Peng, R. -. C., Qiao, J. -. D. Protective effect of CACNA1A deficiency against seizure in the CACNA1A-CELSR2 digenic knockdown flies. Research Square. , (2023).
- Uchitel, O. D., Inchauspe, C. G., Urbano, F. J. D. i., Guilmi, M. N. Cav2.1 voltage activated calcium channels and synaptic transmission in familial hemiplegic migraine pathogenesis. J Physiol Paris. 106 (1-2), 12-22 (2012).
- Le Roux, M., et al. Cacna1a-associated epilepsy: Electroclinical findings and treatment response on seizures in 18 patients. Eur J Paediatr Neurol. 33, 75-85 (2021).
- Alehabib, E., et al. Clinical and molecular spectrum of p/q type calcium channel cav2.1 in epileptic patients. Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 461 (2021).
- Li, X. L., et al. Cacna1a mutations associated with epilepsies and their molecular sub-regional implications. Front Mol Neurosci. 15, 860662 (2022).
- Indelicato, E., Boesch, S. From genotype to phenotype: Expanding the clinical spectrum of cacna1a variants in the era of next generation sequencing. Front Neurol. 12, 639994 (2021).
- Saras, A., Tanouye, M. A. Mutations of the calcium channel gene cacophony suppress seizures in drosophila. Plos Genetics. 12 (1), e1005784 (2016).
- Cozzolino, O., et al. Evolution of epileptiform activity in zebrafish by statistical-based integration of electrophysiology and 2-photon ca2+ imaging. Cells. 9 (3), 769 (2020).
- Mituzaite, J., Petersen, R., Claridge-Chang, A., Baines, R. A. Characterization of seizure induction methods in drosophila. eNeuro. 8 (4), (2021).
- Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S. The joy of balancers. Plos Genetics. 15 (11), e1008421 (2019).
