Ex Vivo(エクス・ビボ )てんかんのショウ ジョウバエ モデルに対するカルシウムイメージング

てんかんは、自発的な発作や予期せぬ発作の再発や神経回路の異常な活動を特徴とする複雑な慢性神経疾患で、世界中で7,000万人以上が罹患しており、最も一般的な神経疾患¹の1つであり、家族や社会の負担が大きい疾患となっています。てんかんの影響を考慮して、発作の病因を特定するために多くの研究が行われており、遺伝学は多くの種類のてんかんまたはてんかん症候群の主な原因として承認されています²。過去数十年にわたり、ゲノム技術の進歩により、イオンチャネル遺伝子や非イオンチャネル遺伝子など、発作の発生に重要な役割を果たす新しいてんかん関連遺伝子の発見が急速に増加しています^3,4。しかし、遺伝子とてんかん表現型の間の根本的なメカニズムと機能解析は完全には理解されていません。てんかん関連の遺伝子とメカニズムを特定することは、患者の効率的な管理の可能性を提供します^5,6。

細胞質カルシウムシグナルは、ニューロンの活動とシナプス伝達における極めて重要な要素です。1970年代以降、脳スライス⁷、in vivo8,9、およびex vivo10を含むカルシウムイメージングは、ニューロンの興奮性のマーカーとしてニューロン活動¹¹をモニターするために利用されてきた^12,13。近年のイメージング技術の進歩は、GCaMP6などの遺伝子コードカルシウム指標(GECI)と組み合わせることで、脳全体および単一細胞の解像度レベル^14,15,16の両方で、時空間精度の高いてんかんの研究に革命をもたらしました。カルシウム濃度の変化と過渡現象は、それぞれ活動電位とシナプス伝達に観察され¹⁴、細胞内カルシウムレベルの変化がニューロンの電気的興奮性と厳密な相関関係を示すことを示している^17,18。カルシウムイメージングは、発生発作モデル⁹としても適用されており、抗けいれん性化合物のスクリーニングのためにショウジョウバエで実施されている¹⁹。

ショウジョウバエは、その高度な分子遺伝学と行動アッセイのために、てんかんなどの科学研究における強力なモデル生物として浮上しています20,21,22。さらに、ショウジョウバエの高度な遺伝学的ツールは、遺伝的にコードされたカルシウム指標GCaMP6の発現に貢献しています。例えば、Gal4およびUASベースのバイナリ転写系は、空間的および時間的に制御された方法でGCaMP6の特異的な発現を可能にします。ショウジョウバエは小さな生物であるため、in vivoカルシウムイメージングは、脳の背側のごく一部のみが小さな窓を通して露出した外科的介入を行うために熟練した操作技術を必要とする^14,23。同時に、ショウジョウバエの無傷の脳におけるex vivoカルシウムイメージングを使用して、脳全体の関心領域(ROI)をモニターできます。

本研究では、GCaMP6を発現する成体ショウジョウバエのex vivoカルシウムイメージングを行い、てんかん様活性をモニタリングする。CACNA1Aよく知られているてんかん遺伝子であるCACは、CACNA1Aの相同体であるCav2チャネルに属しています。まず、cacノックダウンハエtub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAiの脳を解剖し、xytスキャンモードの共焦点顕微鏡を使用してイメージングしました。次に、GCaMP6蛍光の%ΔF/F値やカルシウムイベントなど、自然発作様事象を定量化する指標を計算することにより、ROIのカルシウムシグナルの変化を解析しました。また、ボルテックスマシンによる機械的刺激を行い、カックノックダウンバエの発作行動試験を行い、カルシウムイメージングの結果を検証しました。全体として、このプロトコルは、ex vivoカルシウムイメージングを通じて成虫ショウジョウバエの発作イベントを調査するための貴重なツールを提供し、細胞レベルでのてんかんの潜在的なメカニズムの調査を可能にします。