אקס ויוו הדמיית סידן למודל דרוזופילה לאפילפסיה
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדמיית סידן ex vivo בדרוזופילה למבוגרים המבטאים GCaMP6 לניטור פעילויות אפילפטיפורמיות. הפרוטוקול מספק כלי רב ערך לחקר אירועים איקטליים בדרוזופילה בוגרת באמצעות הדמיית סידן ex vivo , המאפשר לחקור את המנגנונים הפוטנציאליים של אפילפסיה ברמה התאית.
Abstract
אפילפסיה היא הפרעה נוירולוגית המאופיינת בהתקפים חוזרים, בקורלציה חלקית עם מוצא גנטי, המשפיעה על יותר מ-70 מיליון אנשים ברחבי העולם. למרות החשיבות הקלינית של אפילפסיה, הניתוח התפקודי של הפעילות העצבית במערכת העצבים המרכזית עדיין צריך להתפתח. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיית ההדמיה, בשילוב עם ביטוי יציב של מדדי סידן מקודדים גנטית, כגון GCaMP6, חוללו מהפכה בחקר האפילפסיה הן ברמת המוח והן ברמת הרזולוציה של תא בודד. Drosophila melanogaster התפתחה ככלי לחקר המנגנונים המולקולריים והתאיים העומדים בבסיס אפילפסיה בשל הגנטיקה המולקולרית המתוחכמת שלה ומבחני ההתנהגות שלה. במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול חדשני ויעיל להדמיית סידן ex vivo בדרוזופילה למבוגרים המבטאים GCaMP6 לניטור פעילויות אפילפטיפורמיות. המוח כולו מוכן מקאק, גן אפילפסיה ידוע, זבובים להדמיית סידן במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לזהות את הפעילות העצבית כהמשך לבדיקת התנהגות דמוית פרכוס. זבובי ה-cac הראו שיעור גבוה יותר של התנהגות דמוית התקפים ופעילויות סידן חריגות, כולל יותר קוצים גדולים ופחות קוצים קטנים מאשר זבובי בר. פעילויות הסידן היו בקורלציה להתנהגות דמוית התקף. מתודולוגיה זו משמשת כמתודולוגיה יעילה בסינון הגנים הפתוגניים לאפילפסיה ובחקר המנגנון הפוטנציאלי של אפילפסיה ברמה התאית.
Introduction
אפילפסיה, הפרעה נוירולוגית כרונית מורכבת המאופיינת בהישנות של התקפים ספונטניים וללא התגרות ופעילות חריגה ברשת העצבית, השפיעה על יותר מ -70 מיליון אנשים ברחבי העולם, מה שהופך אותה לאחת המחלות הנוירולוגיות הנפוצות ביותר1 ומוביל לנטל כבד של משפחות וחברה. בהתחשב בהשפעת האפילפסיה, נערכו מחקרים רבים לזיהוי האטיולוגיה של התקפים, אשר גנטיקה אושרה כגורם עיקרי לסוגים רבים של אפילפסיה או תסמונות אפילפטיות. בעשורים האחרונים, התקדמות בטכנולוגיות גנומיות הובילה לעלייה מהירה בגילוי גנים חדשים הקשורים לאפילפסיה, הממלאים תפקיד מכריע בהתרחשות פרכוסים, כולל תעלות יונים וגנים שאינם תעלות יונים 3,4. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים והניתוח הפונקציונלי בין הגנים לפנוטיפים אפילפטיים אינם מובנים לחלוטין. זיהוי גנים ומנגנונים הקשורים לאפילפסיה מציע אפשרות לניהול יעיל של חולים 5,6.
אותות סידן ציטוסוליים הם מרכיבים מרכזיים בפעילות העצבית ובהעברה סינפטית. הדמיית סידן, כולל פרוסות מוח7, in vivo 8,9, ו- ex vivo10, שימשה לניטור פעילות עצבית11 כסמן לעוררות עצבית מאז שנות השבעים12,13. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיית ההדמיה, בשילוב עם מדדי הסידן המקודדים גנטית (GECIs), כגון GCaMP6, חוללו מהפכה בחקר האפילפסיה הן ברמת הרזולוציה של המוח הרחב והן ברמת הרזולוציה של תא בודד 14,15,16, שיש לה רמה גבוהה של דיוק מרחבי-זמני. שינויים בריכוז הסידן ובמעברים נצפו בפוטנציאלי פעולה ובשידור סינפטי, בהתאמה14, מה שמצביע על כך שהשינוי ברמות הסידן התוך-תאי מציג מתאם קפדני עם ההתרגשות החשמלית של נוירונים17,18. הדמיית סידן יושמה גם כמודל התקפים התפתחותי9 ובוצעה בדרוזופילה לבדיקת תרכובות נוגדות פרכוסים19.
Drosophila melanogaster כבר מסתמן כאורגניזם מודל רב עוצמה במחקר מדעי, כגון אפילפסיה, עבור גנטיקה מולקולרית מתוחכמת שלה בדיקות התנהגותיות20,21,22. יתר על כן, הכלים הגנטיים המתקדמים בדרוזופילה תרמו לביטוי של אינדיקטור סידן מקודד גנטית GCaMP6. לדוגמה, מערכות השעתוק הבינארי מבוססות Gal4 ו- UAS מאפשרות ביטוי ספציפי של GCaMP6 באופן מבוקר מרחבית וזמנית. מכיוון שדרוזופילה היא אורגניזם זעיר, הדמיית סידן in vivo דורשת מיומנויות תפעול מיומנות כדי לבצע התערבות כירורגית, שבה רק חלק קטן מהגב של המוח נחשף דרך חלון קטן14,23. במקביל, הדמיית סידן ex vivo במוח השלם של דרוזופילה יכולה לשמש לניטור אזורי העניין (ROIs) של המוח כולו.
במחקר זה, אנו מציגים הדמיית סידן ex vivo בדרוזופילה למבוגרים המבטאים GCaMP6 כדי לעקוב אחר פעילויות אפילפטיפורמיות. CACNA1A הוא גן אפילפסיה ידוע, cac שייך ערוץ Cav2, שהוא הומולוג CACNA1A. התחלנו בניתוח המוחות של זבובי cac knockdown tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi והדמיתם באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם מצב סריקה xyt. לאחר מכן ניתחנו את השינויים באותות הסידן של החזר השקעה על ידי חישוב אינדיקטורים המכמתים אירועים דמויי התקפים ספונטניים, כגון ערך %ΔF/F ואירועי סידן של פלואורסצנטיות GCaMP6. בנוסף, ביצענו גירוי מכני על ידי מכונת מערבולת כדי לגרום לבדיקות התנהגות התקפים על זבובי cac-knockdown, כמו גם כדי לאמת את התוצאות של הדמיית סידן. בסך הכל, פרוטוקול זה מספק כלי רב ערך לחקר אירועים איקטליים בדרוזופילה בוגרת באמצעות הדמיית סידן ex vivo , המאפשר לחקור את המנגנונים הפוטנציאליים של אפילפסיה ברמה התאית.
Protocol
Representative Results
Discussion
יון הסידן משמש כשליח שני מכריע, וממלא תפקיד מרכזי במגוון תגובות פיזיולוגיות ופתופיזיולוגיות להפרעות כימיות וחשמליות כאחד. יתר על כן, היסוד הטופולוגי של ערוצי P/Q הפרה-סינפטיים, המקודדים על ידי הגן CACNA1A האדם, זוהה כאחראי לתיווך פריקה של מוליכים עצביים שונים, כולל גלוטמט 30,31,32</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הבסיסית והיישומית של גואנגדונג (מענק מס ‘2022A151111123 לג’ינג-דה קיאו) ותוכנית לשפר את המחקר המדעי ב- GMU (ג’ינג-דה קיאו). עבודה זו נתמכה גם על ידי תוכנית Enihancement Innovation Ability של האוניברסיטה הרפואית של גואנגזו (מימון מס ’02-408-2304-02038XM).
Materials
| Brushes | Panera | AAhc022-2 | for handling flies |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Confocal microscope | SP8; Zeiss, Jena, Germany. | N/A | for calcium imaging |
| CO2 anesthesia machine | N/A | N/A | for Anesthetizing the flies. |
| C-sharp holder | N/A | N/A | handmade, for mounting the brain |
| Culture vials | Biologix | 51-0500 | 2.5 cm diameter, 9.5 cm height |
| Fiji software | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | version: 2.14.0 | for analysis |
| Fly morgue | N/A | N/A | handmade, for handling flies |
| Fly stocks | cac-RNAi | 27244 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | GCaMP6m | 42750 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | tub-Gal4 | N/A | from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| High-resolution camera | N/A | N/A | for recording the seizure-like behavior assay |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Papain suspension | Worthington Biochemical | LS003126 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | SLW1480/02D | for dissection |
| Pipette | Thermo Scientific | 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 | for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Recording dish | Thermo Scientific | 150682- Glass Based Dish | for holding the brain and calcium imaging |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S25550 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| Stereo-binocular microscope | SHANG GUANG | XTZ-D | for handling flies and dissection |
| Syringe needles | pythonbio | HCL0693 | for dissection |
| Tripod | WEIFENG | 45634732523 | for recording the seizure-like behavior assay |
| Vortex mixer | Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich | Z653438 | for performing the seizure-like behavior assay |
| Whiteboard | N/A | N/A | handmade, foam pad or paper for background |
References
- Thijs, R. D., Surges, R., O’brien, T. J., Sander, J. W. Epilepsy in adults. Lancet. 393 (10172), 689-701 (2019).
- Ellis, C. A., Petrovski, S., Berkovic, S. F. Epilepsy genetics: Clinical impacts and biological insights. Lancet Neurol. 19 (1), 93-100 (2020).
- Wang, J., et al. Epilepsy-associated genes. Seizure. 44, 11-20 (2017).
- Oliver, K. L., et al. Genes4epilepsy: An epilepsy gene resource. Epilepsia. 64 (5), 1368-1375 (2023).
- Rogawski, M. A., Loscher, W., Rho, J. M. Mechanisms of action of antiseizure drugs and the ketogenic diet. Cold Spring Harb Perspect Med. 6 (5), 022780 (2016).
- Ademuwagun, I. A., Rotimi, S. O., Syrbe, S., Ajamma, Y. U., Adebiyi, E. Voltage gated sodium channel genes in epilepsy: Mutations, functional studies, and treatment dimensions. Front Neurol. 12, 600050 (2021).
- Leweke, F. M., Louvel, J., Rausche, G., Heinemann, U. Effects of pentetrazol on neuronal activity and on extracellular calcium concentration in rat hippocampal slices. Epilepsy Res. 6 (3), 187-198 (1990).
- Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nat Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
- Hewapathirane, D. S., Dunfield, D., Yen, W., Chen, S., Haas, K. In vivo imaging of seizure activity in a novel developmental seizure model. Exp Neurol. 211 (2), 480-488 (2008).
- Ishimoto, H., Sano, H. Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila. J Vis Exp. 136, 57701 (2018).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Moisescu, D. G., Ashley, C. C., Campbell, A. K. Comparative aspects of the calcium-sensitive photoproteins aequorin and obelin. Biochim Biophys Acta. 396 (1), 133-140 (1975).
- Blinks, J. R., Prendergast, F. G., Allen, D. G. Photoproteins as biological calcium indicators. Pharmacol Rev. 28 (1), 1-93 (1976).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved gcamp calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
- Rochefort, N. L., Jia, H., Konnerth, A. Calcium imaging in the living brain: Prospects for molecular medicine. Trends Mol Med. 14 (9), 389-399 (2008).
- Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. Br J Pharmacol. 163 (8), 1605-1625 (2011).
- Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59 (6), 861-872 (2008).
- Streit, A. K., Fan, Y. N., Masullo, L., Baines, R. A. Calcium imaging of neuronal activity in drosophila can identify anticonvulsive compounds. PLoS One. 11 (2), 0148461 (2016).
- Parker, L., Howlett, I. C., Rusan, Z. M., Tanouye, M. A. Seizure and epilepsy: Studies of seizure disorders in drosophila. Int Rev Neurobiol. 99, 1-21 (2011).
- Del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in drosophila. Nat Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
- Liu, C. Q., et al. Efficient strategies based on behavioral and electrophysiological methods for epilepsy-related gene screening in the drosophila model. Front Mol Neurosci. 16, 1121877 (2023).
- Wang, Y., et al. Genetic manipulation of the odor-evoked distributed neural activity in the drosophila mushroom body. Neuron. 29 (1), 267-276 (2001).
- Wang, J., et al. Unc13b variants associated with partial epilepsy with favourable outcome. Brain. 144 (10), 3050-3060 (2021).
- Ganetzky, B., Wu, C. F. Indirect suppression involving behavioral mutants with altered nerve excitability in drosophila melanogaster. Genetics. 100 (4), 597-614 (1982).
- Roemmich, A. J., Schutte, S. S., O’dowd, D. K. Ex vivo whole-cell recordings in adult drosophila brain. Bio Protoc. 8 (14), 2467 (2018).
- Gu, H., O’dowd, D. K. Whole cell recordings from brain of adult drosophila. J Vis Exp. (6), 248 (2007).
- Qiao, J., Yang, S., Geng, H., Yung, W. H., Ke, Y. Input-timing-dependent plasticity at incoming synapses of the mushroom body facilitates olfactory learning in drosophila. Curr Biol. 32 (22), 4869-4880 (2022).
- Liu, C. -. Q., Lin, Y. -. M., Zhang, X. -. X., Peng, R. -. C., Qiao, J. -. D. Protective effect of CACNA1A deficiency against seizure in the CACNA1A-CELSR2 digenic knockdown flies. Research Square. , (2023).
- Uchitel, O. D., Inchauspe, C. G., Urbano, F. J. D. i., Guilmi, M. N. Cav2.1 voltage activated calcium channels and synaptic transmission in familial hemiplegic migraine pathogenesis. J Physiol Paris. 106 (1-2), 12-22 (2012).
- Le Roux, M., et al. Cacna1a-associated epilepsy: Electroclinical findings and treatment response on seizures in 18 patients. Eur J Paediatr Neurol. 33, 75-85 (2021).
- Alehabib, E., et al. Clinical and molecular spectrum of p/q type calcium channel cav2.1 in epileptic patients. Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 461 (2021).
- Li, X. L., et al. Cacna1a mutations associated with epilepsies and their molecular sub-regional implications. Front Mol Neurosci. 15, 860662 (2022).
- Indelicato, E., Boesch, S. From genotype to phenotype: Expanding the clinical spectrum of cacna1a variants in the era of next generation sequencing. Front Neurol. 12, 639994 (2021).
- Saras, A., Tanouye, M. A. Mutations of the calcium channel gene cacophony suppress seizures in drosophila. Plos Genetics. 12 (1), e1005784 (2016).
- Cozzolino, O., et al. Evolution of epileptiform activity in zebrafish by statistical-based integration of electrophysiology and 2-photon ca2+ imaging. Cells. 9 (3), 769 (2020).
- Mituzaite, J., Petersen, R., Claridge-Chang, A., Baines, R. A. Characterization of seizure induction methods in drosophila. eNeuro. 8 (4), (2021).
- Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S. The joy of balancers. Plos Genetics. 15 (11), e1008421 (2019).
