分子解析のためのヒト水および硝子体リキッドバイオプシーのバイオバンキング

このプロトコルは、米国スタンフォード大学のヒト対象研究のための治験審査委員会(IRB)のガイドラインに準拠しています。 注意: このプロトコルは、資格のある眼科医のためのガイドです。眼内悪性腫瘍の状況では、房水または硝子体リキッドバイオプシーの設定での眼外腫瘍播種を除外することはできません。しかし、経硝子体脈絡膜腫瘍生検では、外眼拡張と眼窩病変のリスクは非常に低く、安全性を高め、入室部位を慎重に検討して行われます6。このプロトコルは網膜芽細胞腫または転移リスクの高い腫瘍の場合にはカバーしておらず、禁忌である可能性があります。 1.サンプル収集前 治験審査委員会の承認 実験開始前に現地のIRBから承認を得て、それに応じてサンプル収集を行います。 研究対象集団 包含基準: 適切な診断テストに必要な量を超える十分な量の房水または硝子体を提供する施設で眼内手術を受けるすべての患者(0〜99歳)を含める 患者の状態と参加を希望する患者を評価するための適切な診断テスト。 除外基準: 参加を拒否した患者と妊婦を除外します。 インフォームドコンセント IRBが承認したプロトコルに従って、各患者から書面によるインフォームドコンセントを取得します。 署名された同意をセキュリティで保護されたデータベースにアーカイブします。 このプロトコルに記載されているように、関与する人員(外科医、検査技師、手術室(OR)スタッフ、科学者)をトレーニングします。 サンプル管理データベースをセットアップします。REDCap を HIPAA 準拠の Web ベースのサンプル データベースとして使用し、調査研究のデータ キャプチャをサポートするように設計されています5.注 : この記事では、REDCap が提供する Web ベースのインターフェイスを使用して、プログラミングに関する広範な知識がなくても、フォームのデザイン、フィールドの定義、分岐ロジックの設定、およびデータの入力規則の適用を行う方法について説明します。あるいは、標準の表計算アプリケーションなどの他のソフトウェアも適している場合があります。 冷却ボックス、ドライアイス、サンプル収集用シリンジ、およびクライオバイアルの可用性を確保します( 材料表を参照)。バイアルに永久にエッチングされるバーコード付きのクライオバイアルを使用してください。これにより、バイアルに患者識別子を追加する必要がなくなり、凍結条件下でラベルを失う可能性がなくなります。 症例について外科医に通知し、予定されている手術の少なくとも24時間前にORでサンプル収集を支援する検査技師に通知します。 2. 手術室での手術検体の取得 モバイル手術室ラボインターフェース(MORLI) 手術室にMORLIを設置します。MORLIには、平らなラボベンチの表面、REDCapデータベースにアクセスできるバーコードスキャナーを備えたコンピューター/タブレット、およびドライアイス付きの冷却ボックスが含まれています( 材料表を参照)。注意: ドライアイスは非常に冷たいです。ドライアイスを取り扱うときは必ず手袋を着用し、触れないでください。 手術室でのサンプル収集の準備 MORLIのコンピュータ/タブレットにログインし、REDCapデータベースを開きます。 インフォームドコンセントが患者によって署名されていることを確認し、外科医に確認します。希釈されていないサンプルが必要であることを彼/彼女に思い出させてください。 手袋を着用してください。適切な数のバーコード付きクライオバイアル(房水の場合は0.5 mL、硝子体サンプルの場合は1.9 mL)を入手し、簡単にアクセスできる場所に置きます。 房水リキッドバイオプシーの収集注意: 人間の組織サンプルはバイオハザード物質と考えてください, 関係者の安全を確保するために、白衣や手袋などの適切な予防措置が必要です.注意: 次の手順は、訓練を受けた眼科医のみが実行する必要があります。房水リキッドバイオプシーは、例えば、世界で最も頻繁な手術の1つである白内障手術の開始時に得ることができる。注:無菌フィールドは、手術室の標準治療プロトコルに従って維持されます。患者の麻酔に関連する術前手順は、前房および硝子体網膜手術の標準治療手順に従います。手術のために目を準備してドレープし、無菌野を最適に視覚化するために滅菌蓋検鏡を配置します。 手術用顕微鏡を使用して、1 mLシリンジに接続された30〜32 Gの針を使用して、辺縁部に垂直な前房副穿刺を行います。この手順の間、綿の先端または小さな鉗子を使用して目を安定させます。注意: 針とシリンジがロックされていること、およびシリンジに圧力がかかっていないことを確認してください(プランジャーを動かすことによって)。眼内構造への損傷を避けるために、針の先端が中央前房の末梢虹彩の上に残っていることを確認してください。白内障手術の場合、リキッドバイオプシーを得るための針は、白内障手術のために作成された穿刺の1つを介して前房に入ることもできます。 顕微鏡による直接可視化下で、1 mLシリンジを使用して約100 μLの原液房水を手動で吸引します。シリンジプランジャーは、外科医の利き手ではない手で、または訓練を受けた助手が針を動かさずに動かします。注:前房が崩壊した場合に備えて、100μL未満の房水を入手してください。 前房から針を慎重に取り外します。注意: 水晶体の目では、レンズに触れないように針を虹彩の上に置いてください。地球への陽圧は逆流を増加させる可能性があります。針が抜かれる前に綿の先端を離すと、逆流を減らすのに役立ちます。 プランジャーを引き戻し、空気と収集された液体がどのように動いているかを確認します。 シリンジをクライオバイアルに注入します。余分な空気はシリンジのデッドスペースをクリアします。 クライオバイアルのバーコードを使用して、手術室のコンピューター上のREDCapフォームにサンプルをスキャンします(詳細は手順3.1〜3.9を参照)。 すぐにクライオバイアルを冷却ボックス内のドライアイスに移します。 患者に予定されている手術を続ける(例えば、前述のような 白内障手術7)。 硝子体リキッドバイオプシーの収集注意: 次の手順は、訓練を受けた硝子体網膜外科医のみが実行する必要があります。硝子体リキッドバイオプシーは、硝子体切除術8の開始時に得ることができる。目標は未希釈の硝子体サンプルを収集することであるため、硝子体切除カッターは液体1でプライミングされません。注:無菌フィールドは、手術室の標準治療プロトコルに従って維持されます。患者の麻酔に関連する術前手順は、前房および硝子体網膜手術の標準治療手順に従います。手術のために目を準備してドレープし、無菌野を最適に視覚化するために滅菌蓋検鏡を配置します。 標準治療手順に従って、23G、25G、または27Gのトロカールカニューレで硬化切開を作成します。注入カニューレを挿入し、硝子体腔内の適切な配置を視覚的に確認します。 硝子体腔内で、注入せずに硝子体カッターを作動させて、希釈されていない硝子体サンプルを収集します。ガラス体押出カニューレ1に接続されたシリンジを用いて0.5〜1.0mLのガラス体を手動で吸引する。 硝子体カッターを目から取り外し、液体注入をオンにします。 チューブ内の残りの液体をシリンジに吸引します。 シリンジを外します。 セクション2.3(ステップ2.3.5からステップ2.3.9)の房水検体について説明しているようにサンプルを処理します。 3. ORでのサンプルの処理とデータベースへのサンプルの追加 ラボの技術者に、準備されたクライオバイアル(房水の場合は0.5 mL、硝子体サンプルの場合は1.9 mL)を採取し、滅菌OR機器に触れることなく外科医のところまで歩いて行くように依頼してください。 ラボの技術者にクライオバイアルを開くように依頼してください。 シリンジをクライオバイアルに直接アンロードします。 ラボの技術者に、すぐにクライオバイアルを要約するように依頼してください。 ラボの技術者にMORLIに戻り、すぐにサンプルを冷却ボックス(-80°C)のドライアイスに移すように依頼してください。箱の蓋を閉めます。 新しいサンプル収集フォームを開きます。フォームのそれぞれのフィールドに次の情報を入力します:症例外科医、収集の場所と日付、患者識別番号、および年齢、性別、右目または左目などの他の基本情報、診断、術前履歴(フリーテキスト)、手順に関する情報(手術の種類など)、および収集されたサンプルの数などのサンプルに関する情報、 サンプルの種類(房水、硝子体)、および容量などの他の詳細。バーコードスキャナーを使用してチューブバーコードを追加します。 [送信/次へ]をクリックします。 追加のサンプルが収集された場合は、手順3.1〜3.7を繰り返します。 すべてのサンプルが保護されたら、REDCap サンプル コレクション フォームの [ 保存して送信] をクリックします。次に、データベースとコンピューター/タブレットからログアウトします。 4. クライオバイアルの保管場所への移送 冷却ボックス内のドライアイスでサンプルを手術室からラボに輸送し、ラボコンピュータの隣のラボベンチに置きます。 ログインIDとパスワードを使用して、ラボのコンピューターでREDCapにログインします。 手袋を着用してください。収集したサンプルの1つを取り、クライオバイアルのバーコードをスキャンしてデータベースに入力します(詳細はセクション5を参照)。すぐにサンプルをドライアイスに戻します。 ドライアイスで満たされた第2の容器を得る。 -80°Cの冷凍庫からクライオバイアル用のラックを入手します。ドライアイスの上の2番目の容器に入れます。注意: 0.5 mLの房水チューブには96フォーマットのラックが必要で、1.9 mLの硝子体チューブには48フォーマットのラックが必要です。 ラックのバーコードをスキャンしてデータベースにします(詳細についてはセクション5を参照)。 サンプルをラックに移します。 ラック内のバイアルの位置をデータベースに追加します(詳細はセクション5を参照)。 [ 保存して送信] をクリックします。 ドライアイス上のバイアルが入ったラックを冷蔵庫に運び、-80°Cで保管します。 座標系を使用して、冷蔵庫内の特定の位置にラックを追加します。これにより、後で下流の分析のためにサンプルを簡単に取得できます。 5.サンプル保管フォーム 入力フォームフェーズ中に収集された各サンプルの保管フォームに記入します。 空の円 または「サンプルストレージ」の下の「+」をクリックして、新しい ストレージ フォームを作成して開きます。 このフォームに記入した日付を [レコードのアーカイブ日] に入力します。 試料チューブバーコードの下に チューブバーコードをスキャンするか入力します。すぐにサンプルをドライアイスに戻します。 サンプルを移すか、サンプルを内部のバイオリポジトリストレージに入れるかを選択します。 書面によるインフォームドコンセントが患者から得られたことを確認し、[同意 コンプライアンスの確認 ]の下のボックスを選択し、[ 同意の確認者]に名前を入力します。 ラック内のクライオバイアルに適した場所を選択します。この位置にあるクライオバイアルをラックに移します(例:位置A1)。ラックをドライアイスの上に置いてください。 [場所]フェーズでは、[冷凍庫]の下の冷凍庫の場所、[棚]の下のサンプルを保管する棚番号、[ボックスバーコード]の下のボックスバーコード、行ごとのボックス内のチューブ位置(チューブ位置(行))および列(チューブ位置(列))の情報を入力します。注意: オプションで、ボックスラベルの下にボックスラベルを入力することもでき、冷凍庫で ボックスを見つけやすくなります。 [使用法]セクションで、次の情報を入力します:サンプルが使用されるプロジェクトの名前(プロジェクト名)、次のカテゴリのいずれかの検体ボリューム:完全、部分的、ほぼ空、または空(検体ボリューム)、および該当する場合はストレージノートの下に保管メモ。注: フォームに最後にアクセスした日付、時刻、およびユーザーは、必要に応じて確認および監査できる管理の連鎖を確保するために自動的に入力されます。 [完了?] の下の [完了] をクリックして、フォームが完成したことを確認します。 [Save & Exit Form] をクリックします。これにより、患者の概要に戻ります。 収集されたチューブごとに、サンプルストレージの下の「+」をクリックして、別の サンプル収集フォームを生成します。次に、手順5.1から5.10を繰り返します。 [ 保存して終了] をクリックしてフォームに入力し、データベースとコンピューター/タブレットからログアウトします。 サンプルラック(ドライアイス上)を冷蔵庫の事前指定位置に移します。 6. 下流分析のための手術検体の回収 注:標本は、分析される前に数年間アーカイブされることがよくあります。バーコード化されたクライオバイアルと検索可能なREDCapデータベースシステムにより、下流の分析のために各サンプルを簡単に見つけて見つけることができます。 データベースの検索機能を使用して、実験の対象となるサンプルを特定します。これにより、例えば、糖尿病性網膜症の20〜40歳の患者からのすべての房水サンプルを見つけることができます。 目的のクライオバイアルの位置(冷凍庫、シェルフ/ラック、サンプルラック、ラック内の座標)を取得します。それらを書き留めるか、印刷するか、モバイルコンピューター/タブレットで利用できるようにして、冷凍庫でサンプルを見つけやすくします。 サンプルをデータベースで使用するものとしてマークします。 [ 保存して終了] をクリックしてフォームに入力し、REDCapとコンピューター/タブレットからログアウトします。