Este protocolo presenta una plataforma integrada de biorepositorio para la recopilación, anotación y biobanco estandarizados de biopsias líquidas vítreas y de humor acuoso humano de alta calidad para análisis moleculares posteriores, incluida la proteómica, la metabolómica y la glucómica.
Un desafío crítico en la investigación traslacional es establecer una interfaz viable y eficiente entre la atención al paciente en la sala de operaciones (OR) y el laboratorio de investigación. Aquí, desarrollamos un protocolo para adquirir biopsias líquidas de alta calidad para análisis moleculares del humor acuoso y el vítreo de pacientes sometidos a cirugía ocular. En este flujo de trabajo, se utiliza un carro Mobile Operating Room Lab Interface (MORLI) equipado con una computadora, un escáner de código de barras e instrumentos de laboratorio, incluido el almacenamiento en frío a bordo, para obtener y archivar muestras biológicas humanas. Una base de datos basada en la web que cumple con la privacidad de datos permite anotar cada muestra durante su vida útil, y un sistema de coordenadas cartesianas permite rastrear cada muestra con código de barras almacenada, lo que permite una recuperación rápida y precisa de muestras para análisis posteriores. La caracterización molecular de muestras de tejido humano no solo sirve como una herramienta de diagnóstico (por ejemplo, para distinguir entre endoftalmitis infecciosa y otra inflamación intraocular no infecciosa), sino que también representa un componente importante de la investigación traslacional, permitiendo la identificación de nuevos objetivos farmacológicos, el desarrollo de nuevas herramientas de diagnóstico y terapias personalizadas.
El perfil molecular de biopsias líquidas del ojo humano puede capturar fluidos enriquecidos localmente que contienen moléculas como ADN, ARN, proteínas, glicanos y metabolitos de tejidos oculares altamente especializados. Las biopsias líquidas del vítreo en la cámara posterior del ojo humano demostraron ser un procedimiento generalmente seguro1. Permiten la caracterización molecular de enfermedades oculares en humanos vivos y ofrecen el potencial de identificar nuevas estrategias diagnósticas y terapéuticas 2,3,4. El humor acuoso en la cámara anterior del ojo tiene una accesibilidad quirúrgica aún mayor y podría obtenerse en grandes cantidades, por ejemplo, durante la cirugía de cataratas, que es una de las cirugías más frecuentes. Sin embargo, hasta ahora no se dispone de un protocolo estandarizado para la recopilación, anotación y bioalmacenamiento de humor acuoso humano y biopsias líquidas vítreas para análisis moleculares posteriores, incluida la proteómica, la metabolómica y la glucómica.
Aquí, desarrollamos un protocolo para la recolección y bioalmacenamiento de biopsias líquidas de alta calidad para análisis moleculares de pacientes sometidos a cirugía ocular. Una interfaz de laboratorio de quirófano móvil (MORLI) permite a un investigador congelar inmediatamente las muestras recogidas en crioviales con código de barras en hielo seco a -80 ° C en la sala de operaciones (OR). Este procedimiento garantiza una calidad de muestra alta y consistente para el análisis molecular posterior. Además de la excelente calidad de la muestra, la anotación precisa de las muestras en un biobanco es fundamental. Utilizandouna base de datos REDCap (captura electrónica de datos de investigación) 5 compatible con HIPAA (Ley de Portabilidad y Responsabilidad del Seguro de Salud) basada en la web, nuestro flujo de trabajo permite el almacenamiento de metadatos detallados para cada muestra, incluida la edad, el sexo, la enfermedad, la etapa de la enfermedad, el tipo de muestra y las características únicas de la cirugía. Esto permitirá una capacidad de búsqueda futura precisa, por ejemplo, para muestras de una enfermedad específica o un grupo particular de pacientes. Además, la ubicación exacta de cada muestra en el congelador se archiva utilizando un sistema de cuadrícula cartesiana, que permite una recuperación eficiente de muestras para experimentos posteriores. Mostramos ejemplos de análisis de ADN, proteínas, glicanos y metabolitos.
Nuestro flujo de trabajo representa una conexión práctica y efectiva entre el quirófano y el laboratorio de investigación y proporciona una base valiosa para la investigación traslacional.
Las muestras quirúrgicas de pacientes permiten la caracterización molecular directa de la enfermedad en humanos vivos 2,3,4,14, y pueden ayudar a superar las limitaciones de los modelos de enfermedades celulares y animales que no recapitulan completamente la enfermedad humana 15,16. El análisis molecular del tejido humano podría mejorar la selección de nuevas dianas farmacológicas y podría contribuir a una mayor tasa de éxito de los ensayos clínicos y la aprobación de medicamentos17. Además, este enfoque ofrece el potencial para la medicina personalizada, ya que el tejido obtenido conserva la huella genómica, epigenómica, metabolómica, glucómica y proteómica única de cada individuo 2,18,19.
La calidad de muestra alta y consistente es fundamental para todas las aplicaciones de análisis molecular. Estudios previos han demostrado que la congelación inmediata después de la recuperación de la muestra y evitar ciclos repetidos de congelación/descongelación son críticos para altas calidades de muestra 9,20. El almacenamiento a largo plazo durante varios años a -70 °C no afectó significativamente la integridad del perfil proteómico9. Un protocolo estandarizado es una base importante para reducir el sesgo y mejorar la comparabilidad de los datos científicos, especialmente cuando varias personas (cirujanos, técnicos y otros) o diferentes instituciones están involucradas en el proceso de muestreo. Además de la calidad de la muestra, la anotación de las muestras es otro factor importante que requiere estandarización para permitir la correlación de los hallazgos moleculares con los datos clínicos. Nuestro protocolo se basa en tres principios esenciales para lograr esto: 1) un procedimiento de muestreo estandarizado para el humor acuoso y biopsias líquidas vítreas por un cirujano oftalmológico, 2) el procesamiento inmediato y la congelación rápida de muestras en el quirófano por parte del personal del laboratorio, y 3) una anotación de metadatos de cada muestra en una base de datos basada en la web que permite a los investigadores encontrar rápidamente muestras para experimentos posteriores.
Además de las muestras vítreas20, este flujo de trabajo también establece la colección estandarizada de biopsias líquidas de humor acuoso para el análisis molecular. El humor acuoso es un líquido complejo y altamente accesible en la cámara anterior del ojo que no sólo refleja enfermedades oculares del segmento anterior sino también del segmento posterior del ojo, incluyendo la enfermedad retiniana18,21. Junto con el hecho de que se puede recolectar un gran número de muestras de humor acuoso, por ejemplo, durante la cirugía de cataratas, una de las cirugías más frecuentes en todo el mundo, estas características la convierten en una fuente interesante de biopsias líquidas del ojo humano. La anotación estandarizada de metadatos de cada muestra establecida en este flujo de trabajo también podría permitir la correlación de los datos del proteoma con los datos de seguimiento clínico prospectivo. Esto brinda la emocionante oportunidad de identificar nuevos biomarcadores pronósticos que pueden ayudar a estimar el pronóstico para futuros pacientes.
Sin embargo, el análisis molecular de muestras quirúrgicas humanas también tiene limitaciones importantes. Por ejemplo, las manipulaciones experimentales complejas a menudo solo son posibles en modelos animales y celulares. Una solución puede ser comparar el perfil molecular de modelos animales o celulares con el de la enfermedad humana. Esta estrategia puede identificar biomarcadores de proteínas superpuestos y dianas terapéuticas que pueden ser validadas en animales o modelos celulares para identificar los candidatos más prometedores que se correlacionan con la enfermedad humana y que tienen probabilidades de tener éxito en los ensayos clínicos 4,16.
En conclusión, nuestro flujo de trabajo establece una interfaz práctica entre el quirófano y el laboratorio de investigación que permite la recolección, anotación y almacenamiento estandarizados y de alto rendimiento de muestras quirúrgicas de alta calidad para el análisis molecular posterior, proporcionando una base valiosa para futuras investigaciones traslacionales.
The authors have nothing to disclose.
VBM cuenta con el apoyo de subvenciones de los NIH (R01EY031952, R01EY031360, R01EY030151 y P30EY026877), el Centro de Stanford para Drusas de Disco Óptico e Investigación para Prevenir la Ceguera, Nueva York, EE. JW y DR cuentan con el apoyo de la VitreoRetinal Surgery Foundation, EE. DR cuenta con el apoyo de la beca DARE, patrocinada por la Fundación Lundbeck.
0.5ml Tri-coded Tube, 96-format, External Thread | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 68-0703-12 | used for aqueous humor samples |
1 mL syringe | surgical grade, whatever available in hospital | – | for aqueous humor biopsies |
1.9ml Tri-coded Tube, 48-format, External Thread | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 65-7643 | used for vitreous samples |
3 mL syringe | surgical grade, whatever available in hospital | – | for vitreous biopsies |
30-32-gauge needle | surgical grade, whatever available in hospital | – | for aqueous humor biopsies |
Capillary electrophoresis coupled with Fourier transformed mass spectrometry (CE-FTMS) | Human Metabolome Technologies, Inc., Tsuruoka, Japan | – | – |
Constellation vitrectomy system with 23-, 25-, or 27-gauge trocar cannula system | Alcon Laboratories Inc, Fort Worth, TX, USA | – | for vitreous biopsies |
Cooling box | Standard styrofoam box, whatever available in lab | – | – |
Dry ice | Whatever available in lab | – | – |
Handsfree Standard Range Scanner Kit with Shielded USB Cable | Zebra Symbol | DS9208-SR4NNU21Z | Barcode scanner |
Human Glycosylation Antibody Array L3 | RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA | GAH-GCM-L3 | – |
Mac mini | Apple Inc., Cupertino, CA 95014, USA | – | – |
MetaboAnalyst software | Pang et al., 2021, PMID: 34019663 | – | – |
Rack for 0.5ml tubes, 96-Format | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 66-51026 | for aqueous humor samples |
Rack for 1.9ml tubes, 48-Format | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 65-9451 | for vitreous samples |
REDCap browser-based sample database | REDCap Consortium, Vanderbilt University, https://www.project-redcap.org | – | – |