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Medicine

Biobanking von humanen wässrigen und glasartigen Flüssigbiopsien für molekulare Analysen

Published: September 11, 2023
doi:
10.3791/65804
, , , , , , , , , , ,
1Molecular Surgery Laboratory,Stanford University, 2Department of Ophthalmology, Byers Eye Institute,Stanford University, 3Department of Ophthalmology and Visual Neurosciences,University of Minnesota, 4Retina Consultants of Minnesota, 5Department of Pediatrics,University of Iowa, 6Department of Neurology,University of Iowa, 7The Iowa Neuroscience Institute (INI),University of Iowa, 8Department of Physiology and Pharmacology, Cumming School of Medicine,University of Calgary, 9Department of Biochemistry and Molecular Biology, Cumming School of Medicine,University of Calgary, 10Veterans Affairs Palo Alto Health Care System

Summary

Dieses Protokoll stellt eine integrierte Biorepository-Plattform für die standardisierte Sammlung, Annotation und Biobank von hochwertigen humanen Kammerwasser- und Glaskörper-Flüssigbiopsien für molekulare Downstream-Analysen, einschließlich Proteomik, Metabolomik und Glykomik, dar.

Abstract

Eine entscheidende Herausforderung in der translationalen Forschung ist die Etablierung einer tragfähigen und effizienten Schnittstelle zwischen der Patientenversorgung im Operationssaal (OP) und dem Forschungslabor. Hier haben wir ein Protokoll entwickelt, um qualitativ hochwertige Flüssigbiopsien für molekulare Analysen aus dem Kammerwasser und dem Glaskörper von Patienten zu gewinnen, die sich einer Augenoperation unterziehen. In diesem Workflow wird ein MORLI-Wagen (Mobile Operating Room Lab Interface) verwendet, der mit einem Computer, einem Barcode-Scanner und Laborinstrumenten, einschließlich eines Kühlhauses an Bord, ausgestattet ist, um menschliche biologische Proben zu entnehmen und zu archivieren. Eine webbasierte, datenschutzkonforme Datenbank ermöglicht die Kommentierung jeder Probe während ihrer gesamten Lebensdauer, und ein kartesisches Koordinatensystem ermöglicht die Verfolgung jeder mit Barcode versehenen Probe im Lager, was einen schnellen und genauen Abruf von Proben für nachgelagerte Analysen ermöglicht. Die molekulare Charakterisierung menschlicher Gewebeproben dient nicht nur als diagnostisches Werkzeug (z. B. zur Unterscheidung zwischen infektiöser Endophthalmitis und anderen nicht-infektiösen intraokularen Entzündungen), sondern stellt auch einen wichtigen Bestandteil der translationalen Forschung dar, die die Identifizierung neuer Wirkstoffziele, die Entwicklung neuer diagnostischer Werkzeuge und personalisierter Therapeutika ermöglicht.

Introduction

Die molekulare Profilierung von Flüssigbiopsien aus dem menschlichen Auge kann lokal angereicherte Flüssigkeiten erfassen, die Moleküle wie DNA, RNA, Proteine, Glykane und Metaboliten aus hochspezialisiertem Augengewebe enthalten. Flüssigbiopsien aus dem Glaskörper in der hinteren Augenkammer erwiesen sich als allgemein sicheres Verfahren1. Sie ermöglichen die molekulare Charakterisierung von Augenerkrankungen beim lebenden Menschen und bieten das Potenzial, neue diagnostische und therapeutische Strategien zu identifizieren 2,3,4. Das Kammerwasser in der vorderen Augenkammer ist noch besser chirurgisch zugänglich und kann in großer Zahl gewonnen werden, z. B. bei einer Kataraktoperation, die zu den am häufigsten durchgeführten Operationen gehört. Bisher ist jedoch kein standardisiertes Protokoll für die Sammlung, Annotation und Biobank von humanen Kammerwasser- und Glaskörper-Flüssigbiopsien für molekulare Downstream-Analysen, einschließlich Proteomik, Metabolomik und Glykomik, verfügbar.

Hier haben wir ein Protokoll für die Entnahme und das Biobanking von hochwertigen Flüssigbiopsien für molekulare Analysen von Patienten entwickelt, die sich einer Augenoperation unterziehen. Ein mobiles Labor-Interface für den Operationssaal (MORLI) ermöglicht es einem Forscher, die gesammelten Proben in kryorischen Fässern mit Barcode sofort auf Trockeneis bei -80 °C im Operationssaal (OR) einzufrieren. Dieses Verfahren gewährleistet eine hohe und gleichbleibende Probenqualität für die nachgelagerte molekulare Analyse. Neben einer exzellenten Probenqualität ist die genaue Annotation von Proben in einer Biobank von entscheidender Bedeutung. Unter Verwendung einer webbasierten HIPAA-konformen (Health Insurance Portability and Accountability Act)-konformen REDCap-Datenbank (Research Electronic Data Capture)5 ermöglicht unser Workflow die Speicherung detaillierter Metadaten für jede Probe, einschließlich Alter, Geschlecht, Krankheit, Krankheitsstadium, Probentyp und einzigartige Merkmale der Operation. Dies ermöglicht eine genaue zukünftige Suchkapazität, z. B. nach Proben einer bestimmten Krankheit oder einer bestimmten Patientengruppe. Darüber hinaus wird die genaue Position jeder Probe im Gefrierschrank über ein kartesisches Gittersystem archiviert, was eine effiziente Probenentnahme für nachgelagerte Experimente ermöglicht. Wir zeigen Beispiele für DNA-, Protein-, Glykan- und Metabolitenanalysen.

Unser Workflow stellt eine praktische und effektive Verbindung zwischen dem OP und dem Forschungslabor dar und bietet eine wertvolle Grundlage für die translationale Forschung.

Protocol

Das Protokoll folgt den Richtlinien des Institutional Review Board for Human Subjects Research (IRB) an der Stanford University, USA. ACHTUNG: Dieses Protokoll ist ein Leitfaden für qualifizierte Augenchirurgen. Im Rahmen intraokularer Malignome kann eine extraokulare Tumoraussaat im Rahmen von Kammerwasser- oder Glaskörper-Flüssigbiopsien nicht ausgeschlossen werden. Das Risiko einer extraokularen Ausdehnung und Orbitalbeteiligung ist jedoch bei der transvitrealen Aderhauttumorbiopsie, d.h. unter Berücksichtigung der Eintrittsstelle und unter sorgfältiger Berücksichtigung der Eintrittsstelle äußerst gering6. Dieses Protokoll deckt Fälle von Retinoblastomen oder Tumoren mit hohem Metastasenrisiko nicht ab und kann kontraindiziert sein. 1. Vor der Probenentnahme Genehmigung durch den institutionellen Prüfungsausschuss Holen Sie vor Beginn des Experiments die Genehmigungen des lokalen IRB ein und führen Sie die Probenentnahme entsprechend durch. Studienpopulation Einschlusskriterien: Schließen Sie alle Patienten (im Alter von 0 bis 99 Jahren) ein, die sich in der Einrichtung einer intraokularen Operation unterziehen, die eine ausreichende Menge an Kammerwasser oder Glaskörperflüssigkeit liefert, die über das hinausgeht, was für geeignete diagnostische Tests zur Beurteilung des Zustands des Patienten erforderlich ist, sowie Patienten, die teilnehmen möchten. Ausschlusskriterien: Ausschluss von Patienten, die die Teilnahme ablehnen, und schwangeren Frauen. Informed Consent Holen Sie von jedem Patienten eine schriftliche Einverständniserklärung ein, die dem vom IRB genehmigten Protokoll entspricht. Archivieren Sie die unterschriebene Einwilligung in einer gesicherten Datenbank. Schulung des beteiligten Personals (Chirurgen, Labortechniker, OP-Personal, Wissenschaftler), wie in diesem Protokoll beschrieben. Richten Sie ein Beispiel für die Verwaltung einer Datenbank ein. Verwenden Sie REDCap als HIPAA-konforme, webbasierte Probendatenbank, die zur Unterstützung der Datenerfassung für Forschungsstudien entwickelt wurde5.HINWEIS: Dieser Artikel beschreibt die Verwendung der webbasierten Schnittstelle von REDCap, um Formulare zu entwerfen, Felder zu definieren, Verzweigungslogik einzurichten und Datenvalidierungsregeln anzuwenden, ohne dass umfangreiche Programmierkenntnisse erforderlich sind. Alternativ kann auch andere Software, wie z. B. Standard-Tabellenkalkulationsprogramme, geeignet sein. Stellen Sie sicher, dass eine Kühlbox, Trockeneis, eine Spritze zur Probenentnahme und Kryogefäße zur Verfügung stehen (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie Kryogefäße mit Barcodes, die dauerhaft auf die Fläschchen geätzt sind. Dadurch entfällt die Notwendigkeit, Patientenidentifikatoren auf der Durchstechflasche hinzuzufügen, und die Möglichkeit, ein Etikett unter Gefrierbedingungen zu verlieren. Informieren Sie den Chirurgen über den Fall und den Labortechniker, der bei der Probenentnahme im OP hilft, mindestens 24 Stunden vor der geplanten Operation. 2. Entnahme von chirurgischen Präparaten im Operationssaal Mobile Laborschnittstelle für den Operationssaal (MORLI) Etablieren Sie ein MORLI im Operationssaal. MORLI umfasst eine flache Labortischoberfläche, einen Computer/Tablet mit Barcode-Scanner mit Zugriff auf die REDCap-Datenbank und eine Kühlbox mit Trockeneis (siehe Materialtabelle).ACHTUNG: Trockeneis ist extrem kalt. Tragen Sie beim Umgang mit Trockeneis immer Handschuhe und vermeiden Sie es, es zu berühren. Vorbereitung der Probenentnahme im OP Loggen Sie sich in den Computer/das Tablet von MORLI ein und öffnen Sie die REDCap-Datenbank. Überprüfen Sie, ob die Einverständniserklärung vom Patienten unterschrieben wurde, und bestätigen Sie dies mit dem Chirurgen. Erinnern Sie ihn/sie daran, dass eine unverdünnte Probe erforderlich ist. Tragen Sie Handschuhe. Besorgen Sie sich die entsprechende Anzahl von Kryovials mit Barcode (0,5 ml für Kammerwasser und 1,9 ml für Glaskörperproben) und platzieren Sie sie an einem Ort, an dem sie leicht zugänglich sind. Entnahme von Kammerwasser-FlüssigbiopsienVORSICHT: Betrachten Sie menschliche Gewebeproben als biologisch gefährliches Material, das geeignete Vorsichtsmaßnahmen wie einen Laborkittel und Handschuhe erfordert, um die Sicherheit des beteiligten Personals zu gewährleisten.HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten nur von einem ausgebildeten Augenchirurgen durchgeführt werden. Kammerwasser-Flüssigbiopsien können zum Beispiel zu Beginn einer Kataraktoperation, einer der häufigsten Operationen weltweit, gewonnen werden.HINWEIS: Im Operationssaal wird ein steriles Feld gemäß den Standard-Pflegeprotokollen aufrechterhalten. Präoperative Verfahren im Zusammenhang mit der Patientenanästhesie folgen den Standardbehandlungsschritten für Vorderkammer- und vitreoretinale Operationen.Bereiten Sie das Auge für die Operation vor, drapieren Sie es und platzieren Sie ein steriles Deckelspekulum für eine optimale Visualisierung des sterilen Feldes. Verwenden Sie ein Operationsmikroskop, um eine Vorderkammerparazentese senkrecht zum Limbus mit einer 30-32 G-Nadel durchzuführen, die mit einer 1-ml-Spritze verbunden ist. Verwenden Sie eine Wattestäbchen oder eine kleine Pinzette, um das Auge während dieses Eingriffs zu stabilisieren.Anmerkungen: Stellen Sie sicher, dass die Nadel und die Spritze verriegelt sind und kein Druck in der Spritze vorhanden ist (durch Bewegen des Kolbens). Achten Sie darauf, dass die Nadelspitze über der peripheren Iris in der mittleren Vorderkammer bleibt, um eine Schädigung der intraokularen Strukturen zu vermeiden. Bei der Kataraktoperation kann die Nadel zur Entnahme der Flüssigbiopsie auch über eine der Parazentesen, die für die Kataraktoperation angelegt werden, in die Vorderkammer gelangen. Unter direkter Visualisierung über das Mikroskop werden ca. 100 μl unverdünntes Kammerwasser mit einer 1-ml-Spritze manuell abgesaugt. Bewegen Sie den Spritzenkolben mit der nicht dominanten Hand des Chirurgen oder durch einen geschulten Assistenten, ohne die Nadel zu bewegen.Anmerkungen: Besorgen Sie sich weniger als 100 μl Kammerwasser für den Fall, dass die Vorderkammer kollabieren sollte. Entfernen Sie die Nadel vorsichtig aus der Vorderkammer.Anmerkungen: Halten Sie die Nadel bei einem phaken Auge über die Iris, um zu vermeiden, dass die Linse berührt wird. Überdruck auf den Globus kann den Reflux verstärken. Das Loslassen der Wattestäbchenspitze, bevor die Nadel zurückgezogen wird, hilft, Reflux zu reduzieren. Ziehen Sie den Kolben zurück und sehen Sie, wie sich die Luft und die gesammelte Flüssigkeit bewegen. Injizieren Sie die Spritze in das Kryogefäß. Die zusätzliche Luft befreit den Totraum der Spritze. Verwenden Sie den Barcode auf dem Kryogefäß, um die Probe in das REDCap-Formular auf einem Computer im Operationssaal zu scannen (weitere Details in den Schritten 3.1 bis 3.9). Übertragen Sie das Kryogefäß sofort auf Trockeneis in der Kühlbox. Fahren Sie mit der für den Patienten geplanten Operation fort (z. B. eine Kataraktoperation wie zuvor beschrieben7 ). Entnahme von Glaskörper-FlüssigbiopsienHINWEIS: Die folgenden Schritte sollten nur von einem ausgebildeten vitreoretinalen Chirurgen durchgeführt werden. Glaskörper-Flüssigbiopsien können zu Beginn einer Vitrektomie entnommen werden8. Da das Ziel darin besteht, eine unverdünnte Glaskörperprobe zu entnehmen, wird der Vitrektomieschneider nicht mit Flüssigkeit1 grundiert.HINWEIS: Im Operationssaal wird ein steriles Feld gemäß den Standard-Pflegeprotokollen aufrechterhalten. Präoperative Verfahren im Zusammenhang mit der Patientenanästhesie folgen den Standardbehandlungsschritten für Vorderkammer- und vitreoretinale Operationen.Bereiten Sie das Auge für die Operation vor, drapieren Sie es und platzieren Sie ein steriles Deckelspekulum für eine optimale Visualisierung des sterilen Feldes. Erstellen Sie Sklerotomien mit einer 23-, 25- oder 27-G-Trokarkanüle gemäß den Standardbehandlungsverfahren. Führen Sie die Infusionskanüle ein und bestätigen Sie visuell die entsprechende Platzierung in der Glaskörperhöhle. Aktivieren Sie in der Glaskörperhöhle den Glaskörperschneider ohne Infusion, um eine unverdünnte Glaskörperprobe zu entnehmen. Saugen Sie 0,5 bis 1,0 ml Glaskörper manuell mit einer Spritze ab, die mit der Glaskörper-Extrusionskanüle1 verbunden ist. Entfernen Sie den Glaskörperschneider aus dem Auge und schalten Sie die Flüssigkeitsinfusion ein. Saugen Sie die verbleibende Flüssigkeit aus dem Schlauch in die Spritze. Trennen Sie die Spritze. Verarbeiten Sie die Probe wie in Abschnitt 2.3 (Schritt 2.3.5 bis Schritt 2.3.9) für eine Kammerwasserprobe beschrieben. 3. Verarbeitung von Proben im OP und Hinzufügen von Proben zur Datenbank Bitten Sie den Labortechniker, das vorbereitete Kryogefäß (0,5 ml für Kammerwasser und 1,9 ml für Glaskörperproben) zu entnehmen und zum Chirurgen zu gehen, ohne sterile OP-Geräte zu berühren. Bitten Sie den Labortechniker, das Kryogefäß zu öffnen. Entladen Sie die Spritze direkt in das Kryogeschoss. Bitten Sie den Labortechniker, das Kryogefäß sofort zu rekapitulieren. Bitten Sie den Labortechniker, zurück zum MORLI zu gehen und die Probe sofort auf Trockeneis in der Kühlbox (-80 °C) zu übertragen. Schließen Sie den Deckel der Box. Öffnen Sie ein neues Formular für die Probenentnahme. Geben Sie folgende Informationen in das entsprechende Feld des Formulars ein: Fallchirurg, Ort und Datum der Entnahme, Patientenidentifikationsnummer und andere grundlegende Informationen wie Alter, Geschlecht, rechtes oder linkes Auge, Diagnose, präoperative Anamnese (Freitext), Informationen über den Eingriff (z. B. Art der Operation) sowie Informationen über die Proben, wie z. B. Anzahl der entnommenen Proben, Art der Proben (Kammerwasser, Glaskörper) und andere Details wie Volumen. Fügen Sie den Tube-Barcode mit dem Barcode-Scanner hinzu. Klicken Sie auf Senden/Weiter. Wiederholen Sie die Schritte 3.1 bis 3.7, wenn weitere Proben entnommen werden. Wenn alle Proben gesichert sind, klicken Sie auf dem REDCap-Probenentnahmeformular auf Speichern und senden . Melden Sie sich dann von der Datenbank und dem Computer/Tablet ab. 4. Überführung von Kryomaterialien in die Lagerung Transportieren Sie die Proben auf Trockeneis in der Kühlbox vom OP ins Labor und legen Sie sie auf einen Labortisch neben einem Laborcomputer. Melden Sie sich auf dem Laborrechner mit Ihrer Login-ID und Ihrem Passwort bei REDCap an. Tragen Sie Handschuhe. Entnehmen Sie eine der entnommenen Proben und scannen Sie den Barcode des Kryos in die Datenbank ein (mehr dazu in Abschnitt 5). Legen Sie die Probe sofort wieder auf Trockeneis. Besorge dir einen zweiten Behälter, der mit Trockeneis gefüllt ist. Holen Sie sich ein Gestell für die Kryogefäße aus dem -80 °C warmen Gefrierschrank. Legen Sie es in den zweiten Behälter auf Trockeneis.HINWEIS: Für die 0,5-ml-Kammerwasserröhrchen wird ein Rack im 96er-Format und für die 1,9-ml-Glaskörperröhrchen ein Rack im 48er-Format benötigt. Scannen Sie den Barcode des Regals in die Datenbank (weitere Details finden Sie in Abschnitt 5). Übertragen Sie die Probe in das Rack. Fügen Sie die Position der Fläschchen im Rack zur Datenbank hinzu (weitere Informationen finden Sie in Abschnitt 5). Klicken Sie auf Speichern und senden. Transportieren Sie das Gestell mit den Durchstechflaschen auf Trockeneis in den Kühlschrank, um es bei -80 °C zu lagern. Fügen Sie den Rost mithilfe eines Koordinatensystems an einer bestimmten Position im Kühlschrank hinzu. Dies ermöglicht später die einfache Entnahme von Proben für die nachgelagerte Analyse. 5. Formular zur Probenaufbewahrung Füllen Sie für jede Probe, die während der Phase des Eingabeformulars entnommen wird, ein Aufbewahrungsformular aus. Klicken Sie auf den leeren Kreis oder das “+” unter Probenspeicher , um ein neues Speicherformular zu erstellen und zu öffnen. Geben Sie das Datum, an dem dieses Formular ausgefüllt wurde, unter Archivierungsdatum des Datensatzes ein. Scannen Sie den Tuben-Barcode oder geben Sie ihn unter Specimen Tube Barcode ein. Legen Sie die Probe sofort wieder auf Trockeneis. Wählen Sie aus, ob eine Probe ausgelagert wird oder ob die Probe in ein internes Biorepository-Lager überführt wird. Vergewissern Sie sich, dass eine schriftliche Einwilligungserklärung des Patienten eingeholt wurde, aktivieren Sie das Kontrollkästchen unter Einwilligungskonformität überprüfen und geben Sie Ihren Namen unter Einwilligung verifiziert durch ein. Wählen Sie einen freien und geeigneten Platz für das Kryo im Rack. Übertragen Sie das Kryogefäß an dieser Position in das Rack (z. B. Position A1). Bewahren Sie das Gestell auf Trockeneis auf. Geben Sie in der Phase Standort die folgenden Informationen ein: den Standort des Gefrierschranks unter Gefrierschrank, die Regalnummer, in der die Probe unter Regal gelagert wird, den Karton-Barcode unter Karton-Barcode, die Position des Röhrchens in der Box zeilenweise (Röhrchenposition (Zeile)) und Spalte (Röhrchenposition (Spalte)).HINWEIS: Optional kann unter Kartonetikett auch ein Kartonetikett eingegeben werden, das das Auffinden des Kartons im Gefrierschrank erleichtern kann. Geben Sie im Abschnitt Verwendung die folgenden Informationen ein: den Namen des Projekts, für das die Probe verwendet wird (Projektname), das Probenvolumen in einer der folgenden Kategorien: voll, teilweise, fast leer oder leer (Probenvolumen) und ggf. Lagerhinweise unter Lagerhinweise.HINWEIS: Das Datum, die Uhrzeit und der Benutzer, der zuletzt auf das Formular zugegriffen hat, werden automatisch ausgefüllt, um eine Kontrollkette zu gewährleisten, die bei Bedarf überprüft und geprüft werden kann. Vergewissern Sie sich, dass das Formular ausgefüllt ist, indem Sie unter Abschließen auf Abschließen klicken. Klicken Sie auf Save & Exit Form. Damit gelangen Sie zurück zur Patientenübersicht. Generieren Sie für jedes entnommene Röhrchen ein weiteres Probenentnahmeformular, indem Sie auf das “+” unter Probenlagerung klicken. Wiederholen Sie dann die Schritte 5.1 bis 5.10. Klicken Sie auf Speichern und Beenden , um das Formular auszufüllen und sich von der Datenbank und dem Computer/Tablet abzumelden. Stellen Sie das Probenrack (auf Trockeneis) an der vorgegebenen Position in den Kühlschrank. 6. Entnahme von chirurgischen Proben für die nachgelagerte Analyse HINWEIS: Proben werden oft mehrere Jahre archiviert, bevor sie analysiert werden. Die mit Barcodes versehenen Kryogeräte und das durchsuchbare REDCap-Datenbanksystem ermöglichen es, jede Probe für die nachgelagerte Analyse leicht zu finden und zu lokalisieren. Identifizieren Sie Stichproben, die für das Experiment von Interesse sind, indem Sie die Suchfunktion der Datenbank verwenden. Damit können z.B. alle Kammerwasserproben von Patienten zwischen 20 und 40 Jahren mit diabetischer Retinopathie gefunden werden. Ermitteln Sie die Position der interessierenden Kryogefäße (Gefrierschrank, Regal/Rack, Probenrack, Koordinaten innerhalb des Racks). Schreiben Sie sie auf, drucken Sie sie aus oder halten Sie sie auf einem mobilen Computer/Tablet bereit, um das Auffinden der Proben im Gefrierschrank zu erleichtern. Markieren Sie die Beispiele als in der Datenbank verwendet. Klicken Sie auf Speichern und Beenden , um das Formular auszufüllen und sich von REDCap und dem Computer/Tablet abzumelden.

Representative Results

Die entnommenen Flüssigbiopsieproben können einer Vielzahl von molekularen Analysen unterzogen werden, einschließlich der Analyse von DNA, Proteinen, Glykanen und Metaboliten. Es wurde bereits gezeigt, dass eine Langzeitlagerung über mehrere Jahre bei -70 °C die Integrität des Proteomprofils nicht signifikant beeinträchtigt9. Die REDCap-Datenbank ermöglicht ein einfaches und schnelles Auffinden von Proben. Die Datenbank kann nach Proben einer bestimmten Patientengruppe durchsucht werden, z.B. nach allen Patienten mit diabetischer Retinopathie. Die Datenbank liefert dann die Barcodes der Röhrchen und die Lagerpositionen. Bis heute haben wir mehr als 1.000 Flüssigbiopsien gesammelt und archiviert. Die Datenbank ermöglichte es uns, die Proben für nachgelagerte Analysen schnell zu finden 3,10 und half bei der Durchführung der folgenden Experimente. Eine 17-jährige Frau stellte sich mit einer Entzündung der Netzhaut und des Sehnervs vor. Sie war immungeschwächt und es bestand die Sorge vor einer Infektion. Kammerwasser wurde aus ihrem rechten Auge entnommen und zur DNA-PCR-Analyse geschickt. Die Ergebnisse waren positiv für das Zytomegalievirus und negativ für das Herpes-simplex-Virus und die Toxoplasmose. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass Kammerwasser-Flüssigbiopsien dazu beitragen können, infektiöse von nicht-infektiösen Formen der intraokularen Entzündung zu unterscheiden, was für die Auswahl der geeigneten Therapie entscheidend ist. Die Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie ermöglicht eine unverzerrte und semiquantitative Analyse des Proteoms. In einer Flüssigbiopsie aus dem Glaskörper eines Patienten, der sich einer Vitrektomie unterzog, konnte die Technik 484 einzigartige Proteine identifizieren, darunter Komplement C3 (C3), Opticin (OPTC) und Kollagen Typ II Alpha 1 (COL2A1) (Abbildung 1A). Drei Glaskörper-Flüssigbiopsien wurden mittels eines Glykoproteomik-Multiplex-ELISA analysiert (siehe Materialtabelle)11. Der Assay detektierte die Glykosylierungsprofile von 500 menschlichen Proteinen und erfasste eine Vielzahl biologischer Signalwege, wie z. B. Stoffwechsel, Immunantwort, Zelladhäsion und Aktinorganisation (Abbildung 1B). Ein Metabolomik-Screening mittels Kapillarelektrophorese in Verbindung mit Fourier-transformierter Massenspektrometrie12 (siehe Materialtabelle) identifizierte 292 verschiedene Metaboliten in drei Kammerwasser-Flüssigbiopsieproben. Eine Analyse der Stoffwechselwege (siehe Materialtabelle)13 identifizierte eine Vielzahl von Stoffwechselwegen, darunter den Aminosäurestoffwechsel, den Harnstoffzyklus und die Carnitinsynthese (Abbildung 1C). Abbildung 1: Repräsentative Ergebnisse . (A) Die Proteomik-Analyse des menschlichen Glaskörpers mittels Flüssigkeitschromatographie und Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) identifizierte 484 einzigartige Proteine in einer einzigen Flüssigbiopsie. Die Proteingehalte werden auf der Grundlage von Spektralzahlen angezeigt und eingestuft. Repräsentative Proteine sind blau hervorgehoben. (B) Ein Glykoproteomik-Multiplex-ELISA detektierte Glykosylierungsniveaus von 500 einzigartigen Proteinen in drei Glaskörper-Flüssigbiopsien. Eine STRING-Protein-Interaktionsanalyse identifizierte Cluster von Proteininteraktionen (Cluster mit mindestens 10 Proteinen sind dargestellt). Für jeden Cluster wird der am stärksten angereicherte Signalweg angezeigt. (C) Die Metabolomics-Analyse mittels Massenspektrometrie identifizierte 292 verschiedene Metaboliten in drei Kammerwasser-Flüssigbiopsien. Jeder Punkt stellt eine Stichprobe dar. Die Höhe des Balkens entspricht der mittleren Anzahl der Metaboliten, der Fehlerbalken stellt die Standardabweichung dar. Das rechte Bild zeigt deutlich angereicherte Pfade. Die Anzahl der nachgewiesenen Metaboliten (Zähler) sowie die Gesamtzahl der Metaboliten in jedem Weg (Nenner) werden angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

Chirurgische Proben von Patienten ermöglichen eine direkte molekulare Charakterisierung von Krankheiten bei lebenden Menschen 2,3,4,14 und können dazu beitragen, die Einschränkungen von Zell- und Tierkrankheitsmodellen zu überwinden, die die menschliche Krankheit nicht vollständig rekapitulieren 15,16. Die molekulare Analyse von menschlichem Gewebe könnte die Auswahl neuer Wirkstoffziele verbessern und zu einer höheren Erfolgsquote bei klinischen Studien und Arzneimittelzulassungen beitragen17. Darüber hinaus bietet dieser Ansatz das Potenzial für eine personalisierte Medizin, da das erhaltene Gewebe den einzigartigen genomischen, epigenomischen, metabolomischen, glykomischen und proteomischen Fingerabdruck jedes Individuums behält 2,18,19.

Eine hohe und gleichbleibende Probenqualität ist für alle molekularen Analyseanwendungen von grundlegender Bedeutung. Frühere Studien haben gezeigt, dass das sofortige Einfrieren nach der Probenentnahme und die Vermeidung wiederholter Gefrier-/Auftauzyklen für hohe Probenqualitäten entscheidend sind 9,20. Die Langzeitlagerung über mehrere Jahre bei -70 °C hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Integrität des proteomischen Profils9. Ein standardisiertes Protokoll ist eine wichtige Grundlage, um Verzerrungen zu reduzieren und die Vergleichbarkeit wissenschaftlicher Daten zu verbessern, insbesondere wenn mehrere Personen (Chirurgen, Techniker und andere) oder verschiedene Institutionen am Probenahmeprozess beteiligt sind. Neben der Probenqualität ist die Annotation von Proben ein weiterer wichtiger Faktor, der standardisiert werden muss, um die Korrelation von molekularen Befunden mit klinischen Daten zu ermöglichen. Unser Protokoll stützt sich dabei auf drei wesentliche Prinzipien: 1) ein standardisiertes Probenahmeverfahren für Kammerwasser- und Glaskörperbiopsien durch einen Augenchirurgen, 2) die sofortige Verarbeitung und das Einfrieren von Proben im OP durch Laborpersonal und 3) eine Metadaten-Annotation jeder Probe in einer webbasierten Datenbank, die es den Forschern ermöglicht, Proben für spätere Experimente schnell zu finden.

Neben Glaskörperproben20 etabliert dieser Workflow auch die standardisierte Sammlung von Kammerwasser-Flüssigbiopsien für die molekulare Analyse. Das Kammerwasser ist eine leicht zugängliche, komplexe Flüssigkeit in der vorderen Augenkammer, die nicht nur Augenerkrankungen des vorderen, sondern auch des hinteren Augenabschnitts, einschließlich Netzhauterkrankungen, widerspiegelt18,21. Zusammen mit der Tatsache, dass z.B. bei der Kataraktoperation, einer der weltweit am häufigsten durchgeführten Operationen, eine hohe Anzahl von Kammerwasserproben entnommen werden konnte, machen diese Eigenschaften sie zu einer interessanten Quelle für Flüssigbiopsien aus dem menschlichen Auge. Die standardisierte Metadaten-Annotation jeder Probe, die in diesem Workflow erstellt wurde, könnte auch die Korrelation von Proteomdaten mit prospektiven klinischen Follow-up-Daten ermöglichen. Dies bietet die spannende Möglichkeit, neue prognostische Biomarker zu identifizieren, die helfen können, die Prognose für zukünftige Patienten abzuschätzen.

Die molekulare Analyse menschlicher chirurgischer Präparate weist jedoch auch wichtige Einschränkungen auf. So sind beispielsweise komplexe experimentelle Manipulationen oft nur in Tier- und Zellmodellen möglich. Eine Lösung könnte darin bestehen, das molekulare Profil von Tier- oder Zellmodellen mit dem von menschlichen Krankheiten zu vergleichen. Diese Strategie kann überlappende Protein-Biomarker und therapeutische Ziele identifizieren, die in Tier- oder Zellmodellen validiert werden können, um die vielversprechendsten Kandidaten zu identifizieren, die mit menschlichen Krankheiten korrelieren und wahrscheinlich in klinischen Studien erfolgreich sein werden 4,16.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser Workflow eine praktische Schnittstelle zwischen dem OP und dem Forschungslabor darstellt, die eine standardisierte und hochdurchsatzfähige Sammlung, Annotation und Lagerung hochwertiger chirurgischer Proben für die molekulare Downstream-Analyse ermöglicht und eine wertvolle Grundlage für zukünftige translationale Forschung darstellt.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

VBM wird durch NIH-Zuschüsse (R01EY031952, R01EY031360, R01EY030151 und P30EY026877), das Stanford Center for Optic Disc Drusen und Research to Prevent Blindness, New York, USA, unterstützt. JW und DR werden von der VitreoRetinal Surgery Foundation, USA, unterstützt. DR wird durch das DARE Fellowship unterstützt, das von der Lundbeck Foundation gesponsert wird.

Materials

0.5ml Tri-coded Tube, 96-format, External Thread Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA 68-0703-12 used for aqueous humor samples
1 mL syringe surgical grade, whatever available in hospital – for aqueous humor biopsies
1.9ml Tri-coded Tube, 48-format, External Thread Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA 65-7643 used for vitreous samples
3 mL syringe surgical grade, whatever available in hospital – for vitreous biopsies
30-32-gauge needle surgical grade, whatever available in hospital – for aqueous humor biopsies
Capillary electrophoresis coupled with Fourier transformed mass spectrometry (CE-FTMS) Human Metabolome Technologies, Inc., Tsuruoka, Japan – –
Constellation vitrectomy system with 23-, 25-, or 27-gauge trocar cannula system Alcon Laboratories Inc, Fort Worth, TX, USA – for vitreous biopsies
Cooling box Standard styrofoam box, whatever available in lab – –
Dry ice Whatever available in lab – –
Handsfree Standard Range Scanner Kit with Shielded USB Cable Zebra Symbol  DS9208-SR4NNU21Z Barcode scanner
Human Glycosylation Antibody Array L3  RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA GAH-GCM-L3 –
Mac mini Apple Inc., Cupertino, CA 95014, USA – –
MetaboAnalyst software Pang et al., 2021, PMID: 34019663 – –
Rack for 0.5ml tubes, 96-Format Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA 66-51026 for aqueous humor samples
Rack for 1.9ml tubes, 48-Format Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA 65-9451 for vitreous samples
REDCap browser-based sample database REDCap Consortium, Vanderbilt University, https://www.project-redcap.org – –
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Wolf, J., Chemudupati, T., Kumar, A., Rasmussen, D. K., Wai, K. M., Chang, R. T., Montague, A. A., Tang, P. H., Bassuk, A. G., Dufour, A., Mruthrunjaya, P., Mahajan, V. B. Biobanking of Human Aqueous and Vitreous Liquid Biopsies for Molecular Analyses. J. Vis. Exp. (199), e65804, doi:10.3791/65804 (2023).
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