البنوك الحيوية للخزعات السائلة المائية والزجاجية البشرية للتحليلات الجزيئية
Summary
يقدم هذا البروتوكول منصة مستودع حيوي متكاملة للجمع الموحد والتعليق والبنوك الحيوية للفكاهة المائية البشرية عالية الجودة والخزعات السائلة الزجاجية للتحليلات الجزيئية النهائية ، بما في ذلك البروتينات والأيض والسكريات.
Abstract
يتمثل التحدي الحاسم في البحث الانتقالي في إنشاء واجهة قابلة للتطبيق وفعالة بين رعاية المرضى في غرفة العمليات (OR) ومختبر الأبحاث. هنا ، قمنا بتطوير بروتوكول للحصول على خزعات سائلة عالية الجودة للتحليلات الجزيئية من الخلط المائي والجسم الزجاجي من المرضى الذين يخضعون لجراحة العيون. في سير العمل هذا ، يتم استخدام عربة واجهة مختبر غرفة العمليات المتنقلة (MORLI) المجهزة بجهاز كمبيوتر وماسح ضوئي للرموز الشريطية وأدوات معملية ، بما في ذلك التخزين البارد على متن الطائرة ، للحصول على عينات بيولوجية بشرية وأرشفتها. تتيح قاعدة البيانات المتوافقة مع خصوصية البيانات المستندة إلى الويب التعليق على كل عينة على مدار عمرها ، ويسمح نظام الإحداثيات الديكارتي بتتبع كل عينة مشفرة بالباركود في التخزين ، مما يتيح استرجاع سريع ودقيق للعينات للتحليلات النهائية. لا يعمل التوصيف الجزيئي لعينات الأنسجة البشرية كأداة تشخيصية (على سبيل المثال ، للتمييز بين التهاب باطن المقلة المعدية وغيره من التهابات العين غير المعدية) ولكنه يمثل أيضا مكونا مهما للبحوث الانتقالية ، مما يسمح بتحديد أهداف دوائية جديدة ، وتطوير أدوات تشخيصية جديدة ، وعلاجات شخصية.
Introduction
يمكن أن يلتقط التنميط الجزيئي للخزعات السائلة من العين البشرية السوائل المخصبة محليا التي تحتوي على جزيئات مثل الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتينات والجليكان والمستقلبات من أنسجة العين عالية التخصص. أثبتت الخزعات السائلة من الجسم الزجاجي في الغرفة الخلفية للعين البشرية أنها إجراء آمن بشكل عام1. إنها تسمح بالتوصيف الجزيئي لأمراض العين لدى البشر الأحياء وتوفر إمكانية تحديد استراتيجيات تشخيصية وعلاجية جديدة2،3،4. تتمتع الفكاهة المائية في الغرفة الأمامية للعين بإمكانية وصول جراحية أعلى ويمكن الحصول عليها بأعداد كبيرة ، على سبيل المثال ، أثناء جراحة الساد ، والتي تعد واحدة من أكثر العمليات الجراحية التي يتم إجراؤها بشكل متكرر. ومع ذلك ، لا يتوفر بروتوكول موحد لجمع وشرح والبنوك الحيوية للفكاهة المائية البشرية وخزعات السائل الزجاجي للتحليلات الجزيئية النهائية ، بما في ذلك البروتينات والأيض والسكريات ، حتى الآن.
هنا ، قمنا بتطوير بروتوكول لجمع وتخزين الخزعات السائلة عالية الجودة للتحليلات الجزيئية من المرضى الذين يخضعون لجراحة العيون. تمكن واجهة مختبر غرفة العمليات المتنقلة (MORLI) الباحث من تجميد العينات التي تم جمعها على الفور في كريوفيالات مشفرة على الثلج الجاف عند -80 درجة مئوية في غرفة العمليات (OR). يضمن هذا الإجراء جودة عينة عالية ومتسقة للتحليل الجزيئي النهائي. بالإضافة إلى جودة العينة الممتازة ، يعد التعليق التوضيحي الدقيق للعينات في البنك الحيوي أمرا بالغ الأهمية. باستخدام قاعدة بيانات REDCap (التقاط البيانات الإلكترونية البحثية) المستندة إلى HIPAA (قانون نقل التأمين الصحي والمساءلة)5 ، يسمح سير العمل لدينا بتخزين البيانات الوصفية التفصيلية لكل عينة ، بما في ذلك العمر والجنس والمرض ومرحلة المرض ونوع العينة والميزات الفريدة للجراحة. وسيتيح ذلك قدرة بحث دقيقة في المستقبل، على سبيل المثال، عن عينات من مرض معين أو مجموعة معينة من المرضى. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أرشفة الموقع الدقيق لكل عينة في الفريزر باستخدام نظام الشبكة الديكارتية ، والذي يتيح استرجاع العينات بكفاءة للتجارب النهائية. نعرض أمثلة على تحليلات الحمض النووي والبروتين والجليكان والمستقلب.
يمثل سير العمل لدينا اتصالا عمليا وفعالا بين غرفة العمليات ومختبر الأبحاث ويوفر أساسا قيما للبحث الانتقالي.
Protocol
Representative Results
Discussion
تسمح العينات الجراحية من المرضى بالتوصيف الجزيئي المباشر للمرض في البشر الأحياء2،3،4،14 ، وقد تساعد في التغلب على قيود نماذج أمراض الخلايا والحيوانات التي لا تلخص بشكل كامل المرض البشري15،16. يمكن أن يحسن التحليل الجزيئي للأنسجة البشرية اختيار أهداف دوائية جديدة وقد يساهم في ارتفاع معدل نجاح التجارب السريرية والموافقة على الأدوية17. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر هذا النهج إمكانية الطب الشخصي ، حيث يحتفظ النسيج الذي تم الحصول عليه بالبصمة الجينومية الفريدة ، واللاجينومية ، والأيضية ، والجليكومية ، والبروتينية لكل فرد2،18،19.
تعد جودة العينة العالية والمتسقة أمرا أساسيا لجميع تطبيقات التحليل الجزيئي. أظهرت الدراسات السابقة أن التجميد الفوري بعد استرجاع العينة وتجنب دورات التجميد / الذوبان المتكررة أمر بالغ الأهمية لصفات العينةالعالية 9,20. لم يؤثر التخزين طويل الأجل على مدى عدة سنوات عند -70 درجة مئوية بشكل كبير على سلامة الملف البروتيني9. يعد البروتوكول الموحد أساسا مهما لتقليل التحيز وتحسين قابلية مقارنة البيانات العلمية ، خاصة عندما يشارك العديد من الأشخاص (الجراحين والفنيين وغيرهم) أو مؤسسات مختلفة في عملية أخذ العينات. بصرف النظر عن جودة العينة ، يعد شرح العينات عاملا مهما آخر يتطلب التوحيد القياسي للسماح بربط النتائج الجزيئية بالبيانات السريرية. يعتمد بروتوكولنا على ثلاثة مبادئ أساسية لتحقيق ذلك: 1) إجراء موحد لأخذ العينات للفكاهة المائية وخزعات السائل الزجاجي من قبل جراح العيون ، 2) المعالجة الفورية والتجميد المفاجئ للعينات في غرفة العمليات من قبل موظفي المختبر ، و 3) شرح البيانات الوصفية لكل عينة في قاعدة بيانات على شبكة الإنترنت تسمح للباحثين بالعثور بسرعة على عينات للتجارب اللاحقة.
بالإضافة إلى العينات الزجاجية20 ، يؤسس سير العمل هذا أيضا مجموعة موحدة من خزعات سائل الفكاهة المائية للتحليل الجزيئي. الخلط المائي هو سائل معقد يمكن الوصول إليه للغاية في الغرفة الأمامية للعين لا يعكس فقط أمراض العين الأمامية ولكن أيضا في الجزء الخلفي من العين ، بما في ذلك أمراض الشبكية18,21. إلى جانب حقيقة أنه يمكن جمع عدد كبير من عينات الفكاهة المائية ، على سبيل المثال ، أثناء جراحة الساد ، وهي واحدة من أكثر العمليات الجراحية التي يتم إجراؤها بشكل متكرر في جميع أنحاء العالم ، فإن هذه الميزات تجعلها مصدرا مثيرا للاهتمام للخزعات السائلة من العين البشرية. يمكن أن يسمح شرح البيانات الوصفية الموحدة لكل عينة تم إنشاؤها في سير العمل هذا أيضا بربط بيانات البروتينات ببيانات المتابعة السريرية المستقبلية. وهذا يوفر فرصة مثيرة لتحديد المؤشرات الحيوية النذير الجديدة التي قد تساعد في تقدير التشخيص للمرضى في المستقبل.
ومع ذلك ، فإن التحليل الجزيئي للعينات الجراحية البشرية له أيضا قيود مهمة. على سبيل المثال ، غالبا ما تكون التلاعب التجريبية المعقدة ممكنة فقط في النماذج الحيوانية والخلوية. قد يكون الحل هو مقارنة المظهر الجزيئي للنماذج الحيوانية أو الخلوية مع المرض البشري. يمكن لهذه الاستراتيجية تحديد المؤشرات الحيوية للبروتين المتداخلة والأهداف العلاجية التي يمكن التحقق من صحتها في الحيوانات أو نماذج الخلايا لتحديد المرشحين الواعدين الذين يرتبطون بالأمراض البشرية ومن المرجح أن ينجحوا في التجارب السريرية 4,16.
في الختام ، يؤسس سير العمل لدينا واجهة عملية بين غرفة العمليات ومختبر الأبحاث الذي يسمح بجمع العينات الجراحية عالية الجودة والتعليق عليها وتخزينها بشكل موحد وعالي الإنتاجية للتحليل الجزيئي النهائي ، مما يوفر أساسا قيما للبحوث الانتقالية المستقبلية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم VBM من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة (R01EY031952 و R01EY031360 و R01EY030151 و P30EY026877) ، ومركز ستانفورد للقرص البصري Drusen ، وأبحاث الوقاية من العمى ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية. يتم دعم JW و DR من قبل مؤسسة جراحة الشبكية والجسم الزجاجي ، الولايات المتحدة الأمريكية. يتم دعم DR من قبل زمالة DARE ، التي ترعاها مؤسسة Lundbeck.
Materials
| 0.5ml Tri-coded Tube, 96-format, External Thread | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 68-0703-12 | used for aqueous humor samples |
| 1 mL syringe | surgical grade, whatever available in hospital | – | for aqueous humor biopsies |
| 1.9ml Tri-coded Tube, 48-format, External Thread | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 65-7643 | used for vitreous samples |
| 3 mL syringe | surgical grade, whatever available in hospital | – | for vitreous biopsies |
| 30-32-gauge needle | surgical grade, whatever available in hospital | – | for aqueous humor biopsies |
| Capillary electrophoresis coupled with Fourier transformed mass spectrometry (CE-FTMS) | Human Metabolome Technologies, Inc., Tsuruoka, Japan | – | – |
| Constellation vitrectomy system with 23-, 25-, or 27-gauge trocar cannula system | Alcon Laboratories Inc, Fort Worth, TX, USA | – | for vitreous biopsies |
| Cooling box | Standard styrofoam box, whatever available in lab | – | – |
| Dry ice | Whatever available in lab | – | – |
| Handsfree Standard Range Scanner Kit with Shielded USB Cable | Zebra Symbol | DS9208-SR4NNU21Z | Barcode scanner |
| Human Glycosylation Antibody Array L3 | RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA | GAH-GCM-L3 | – |
| Mac mini | Apple Inc., Cupertino, CA 95014, USA | – | – |
| MetaboAnalyst software | Pang et al., 2021, PMID: 34019663 | – | – |
| Rack for 0.5ml tubes, 96-Format | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 66-51026 | for aqueous humor samples |
| Rack for 1.9ml tubes, 48-Format | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 65-9451 | for vitreous samples |
| REDCap browser-based sample database | REDCap Consortium, Vanderbilt University, https://www.project-redcap.org | – | – |
References
- Mishra, K., et al. Intraoperative complications with vitreous biopsy for molecular proteomics. Ophthalmic Surgeries, Lasers Imaging Retina. 54 (1), 32-36 (2023).
- Velez, G., Bassuk, A. G., Colgan, D., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Therapeutic drug repositioning using personalized proteomics of liquid biopsies. JCI Insight. 2 (24), (2017).
- Velez, G., et al. Liquid biopsy proteomics of uveal melanoma reveals biomarkers associated with metastatic risk. Molecular Cancer. 20 (1), 39 (2021).
- Wert, K. J., et al. Metabolite therapy guided by liquid biopsy proteomics delays retinal neurodegeneration. EBioMedicine. 52, 102636 (2020).
- Harris, P. A., et al. The REDCap consortium: Building an international community of software platform partners. Journal of Biomedical Informatics. 95, 103208 (2019).
- Finn, A. P., Materin, M. A., Mruthyunjaya, P. Choroidal tumor biopsy: A review of the current state and a glance into future techniques. Retina. 38 Suppl 1, S79-S87 (2018).
- Tarantola, R. M., Graff, J. M., Somani, R., Mahajan, V. B. Temporal approach for small-gauge pars plana vitrectomy combined with anterior segment surgery. Retina. 32 (8), 1614-1623 (2012).
- Mahajan, V. B., et al. Sutureless triplanar sclerotomy for 23-gauge vitrectomy. Archives in Ophthalmology. 129 (5), 585-590 (2011).
- Mitchell, B. L., Yasui, Y., Li, C. I., Fitzpatrick, A. L., Lampe, P. D. Impact of freeze-thaw cycles and storage time on plasma samples used in mass spectrometry based biomarker discovery projects. Cancer Informatics. 1 (1), 98-104 (2005).
- Velez, G., et al. Proteomic insight into the pathogenesis of CAPN5-vitreoretinopathy. Science Reports. 9 (1), 7608 (2019).
- Montgomery, M. R., Hull, E. E. Alterations in the glycome after HDAC inhibition impact oncogenic potential in epigenetically plastic SW13 cells. BMC Cancer. 19 (1), 79 (2019).
- Okamoto, N., et al. Comparison of serum metabolomics pathways and patterns between patients with major depressive disorder with and without type 2 diabetes mellitus: An exploratory study. Journal of Integrated Neuroscience. 22 (1), 13 (2023).
- Pang, Z., et al. MetaboAnalyst 5.0: narrowing the gap between raw spectra and functional insights. Nucleic Acids Research. 49 (W1), W388-W396 (2021).
- Wolf, J., et al. The Human Eye Transcriptome Atlas: A searchable comparative transcriptome database for healthy and diseased human eye tissue. Genomics. 114 (2), 110286 (2022).
- Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110 (9), 3507-3512 (2013).
- Wolf, J., et al. Comparative transcriptome analysis of human and murine choroidal neovascularization identifies fibroblast growth factor inducible-14 as phylogenetically conserved mediator of neovascular age-related macular degeneration. Biochimca et Biophysica Acta Molecular Basis of Diseases. 1868 (4), 166340 (2022).
- Dowden, H., Munro, J. Trends in clinical success rates and therapeutic focus. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (7), 495-496 (2019).
- Li, H. T., et al. Characterizing DNA methylation signatures of retinoblastoma using aqueous humor liquid biopsy. Nature Communication. 13 (1), 5523 (2022).
- Velez, G., et al. Personalized proteomics for precision health: identifying biomarkers of vitreoretinal disease. Translational Vision Science and Technology. 7 (5), 12 (2018).
- Skeie, J. M., et al. A biorepository for ophthalmic surgical specimens. Proteomics Clin Applications. 8 (3-4), 209-217 (2014).
- Rinsky, B., et al. Analysis of the aqueous humor proteome in patients with age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 62 (10), 18 (2021).
