Questo protocollo presenta una piattaforma integrata di biorepository per la raccolta, l’annotazione e la biobanca standardizzate di umori acquei umani di alta qualità e biopsie liquide vetrose per analisi molecolari a valle, tra cui proteomica, metabolomica e glicomica.
Una sfida critica nella ricerca traslazionale è stabilire un’interfaccia praticabile ed efficiente tra la cura del paziente in sala operatoria (sala operatoria) e il laboratorio di ricerca. Qui, abbiamo sviluppato un protocollo per l’acquisizione di biopsie liquide di alta qualità per analisi molecolari dall’umore acqueo e dal vitreo da pazienti sottoposti a chirurgia oculare. In questo flusso di lavoro, un carrello Mobile Operating Room Lab Interface (MORLI) dotato di computer, scanner di codici a barre e strumenti di laboratorio, inclusa la conservazione a freddo a bordo, viene utilizzato per ottenere e archiviare campioni biologici umani. Un database basato sul web conforme alla privacy dei dati consente di annotare ogni campione nel corso della sua durata e un sistema di coordinate cartesiane consente di tracciare ogni campione con codice a barre in deposito, consentendo un recupero rapido e accurato dei campioni per le analisi a valle. La caratterizzazione molecolare di campioni di tessuto umano non serve solo come strumento diagnostico (ad esempio, per distinguere tra endoftalmite infettiva e altre infiammazioni intraoculari non infettive), ma rappresenta anche una componente importante della ricerca traslazionale, consentendo l’identificazione di nuovi bersagli farmacologici, lo sviluppo di nuovi strumenti diagnostici e terapie personalizzate.
La profilazione molecolare delle biopsie liquide dall’occhio umano può catturare fluidi arricchiti localmente contenenti molecole come DNA, RNA, proteine, glicani e metaboliti da tessuti oculari altamente specializzati. Le biopsie liquide dal vitreo nella camera posteriore dell’occhio umano si sono dimostrate una procedura generalmente sicura1. Permettono la caratterizzazione molecolare delle malattie oculari nell’uomo vivente e offrono il potenziale per identificare nuove strategie diagnostiche e terapeutiche 2,3,4. L’umore acqueo nella camera anteriore dell’occhio ha un’accessibilità chirurgica ancora più elevata e potrebbe essere ottenuto in gran numero, ad esempio, durante la chirurgia della cataratta, che è uno degli interventi chirurgici più frequentemente eseguiti. Tuttavia, nessun protocollo standardizzato per la raccolta, l’annotazione e la biobanca dell’umore acqueo umano e delle biopsie liquide vitreali per le analisi molecolari a valle, tra cui proteomica, metabolomica e glicomica, è disponibile fino ad ora.
Qui, abbiamo sviluppato un protocollo per la raccolta e la biobanca di biopsie liquide di alta qualità per analisi molecolari da pazienti sottoposti a chirurgia oculare. Una Mobile Operating Room Lab Interface (MORLI) consente a un ricercatore di congelare immediatamente i campioni raccolti in crioviali con codice a barre su ghiaccio secco a -80 °C in sala operatoria (OR). Questa procedura garantisce una qualità del campione elevata e costante per l’analisi molecolare a valle. Oltre all’eccellente qualità dei campioni, l’annotazione accurata dei campioni in una biobanca è fondamentale. Utilizzando un database REDCap (Research Electronic Data Capture) conforme al web HIPAA (Health Insurance Portability and Accountability Act)5, il nostro flusso di lavoro consente l’archiviazione di metadati dettagliati per ciascun campione, tra cui età, sesso, malattia, stadio della malattia, tipo di campione e caratteristiche uniche dell’intervento chirurgico. Ciò consentirà un’accurata capacità di ricerca futura, ad esempio per campioni provenienti da una malattia specifica o da un particolare gruppo di pazienti. Inoltre, la posizione esatta di ciascun campione nel congelatore viene archiviata utilizzando un sistema a griglia cartesiana, che consente un recupero efficiente dei campioni per gli esperimenti a valle. Mostriamo esempi di analisi di DNA, proteine, glicani e metaboliti.
Il nostro flusso di lavoro rappresenta un collegamento pratico ed efficace tra la sala operatoria e il laboratorio di ricerca e fornisce una base preziosa per la ricerca traslazionale.
I campioni chirurgici dei pazienti consentono la caratterizzazione molecolare diretta della malattia negli esseri umani viventi 2,3,4,14 e possono aiutare a superare i limiti dei modelli di malattia cellulare e animale che non ricapitolano completamente la malattia umana 15,16. L’analisi molecolare del tessuto umano potrebbe migliorare la selezione di nuovi bersagli farmacologici e potrebbe contribuire a un più alto tasso di successo delle sperimentazioni cliniche e dell’approvazione dei farmaci17. Inoltre, questo approccio offre il potenziale per la medicina personalizzata, poiché il tessuto ottenuto conserva l’impronta genomica, epigenomica, metabolomica, glicomica e proteomica unica di ogni individuo 2,18,19.
Una qualità del campione elevata e costante è fondamentale per tutte le applicazioni di analisi molecolare. Studi precedenti hanno dimostrato che il congelamento immediato dopo il prelievo del campione e l’evitare ripetuti cicli di congelamento/scongelamento sono fondamentali per un’elevata qualità del campione 9,20. La conservazione a lungo termine per diversi anni a -70 °C non ha influito significativamente sull’integrità del profilo proteomico9. Un protocollo standardizzato è una base importante per ridurre i pregiudizi e migliorare la comparabilità dei dati scientifici, specialmente quando diverse persone (chirurghi, tecnici e altri) o diverse istituzioni sono coinvolte nel processo di campionamento. Oltre alla qualità del campione, l’annotazione dei campioni è un altro fattore importante che richiede la standardizzazione per consentire la correlazione dei risultati molecolari con i dati clinici. Il nostro protocollo si basa su tre principi essenziali per raggiungere questo obiettivo: 1) una procedura di campionamento standardizzata per l’umore acqueo e le biopsie liquide vitreali da parte di un chirurgo oftalmico, 2) l’elaborazione immediata e il congelamento istantaneo dei campioni in sala operatoria da parte del personale di laboratorio e 3) un’annotazione dei metadati di ciascun campione in un database basato sul web che consente ai ricercatori di trovare rapidamente campioni per esperimenti successivi.
Oltre ai campioni vitreali20, questo flusso di lavoro stabilisce anche la raccolta standardizzata di biopsie liquide dell’umore acqueo per l’analisi molecolare. L’umore acqueo è un fluido complesso altamente accessibile nella camera anteriore dell’occhio che non riflette solo le malattie oculari della parte anteriore ma anche del segmento posteriore dell’occhio, compresa la malattia della retina18,21. Oltre al fatto che un numero elevato di campioni di umore acqueo potrebbe essere raccolto, ad esempio, durante la chirurgia della cataratta, uno degli interventi chirurgici più frequentemente eseguiti in tutto il mondo, queste caratteristiche lo rendono una fonte interessante per biopsie liquide dall’occhio umano. L’annotazione standardizzata dei metadati di ciascun campione stabilita in questo flusso di lavoro potrebbe anche consentire la correlazione dei dati del proteoma con i dati prospettici di follow-up clinico. Ciò offre l’entusiasmante opportunità di identificare nuovi biomarcatori prognostici che possono aiutare a stimare la prognosi per i futuri pazienti.
Tuttavia, l’analisi molecolare di campioni chirurgici umani ha anche importanti limiti. Ad esempio, manipolazioni sperimentali complesse sono spesso possibili solo in modelli animali e cellulari. Una soluzione potrebbe essere quella di confrontare il profilo molecolare di modelli animali o cellulari con quello di malattie umane. Questa strategia può identificare biomarcatori proteici sovrapposti e bersagli terapeutici che possono essere convalidati in animali o modelli cellulari per identificare i candidati più promettenti che sono correlati con la malattia umana e che hanno probabilità di successo negli studi clinici 4,16.
In conclusione, il nostro flusso di lavoro stabilisce un’interfaccia pratica tra la sala operatoria e il laboratorio di ricerca che consente la raccolta, l’annotazione e la conservazione standardizzate e ad alta produttività di campioni chirurgici di alta qualità per l’analisi molecolare a valle, fornendo una base preziosa per la futura ricerca traslazionale.
The authors have nothing to disclose.
VBM è supportato da sovvenzioni NIH (R01EY031952, R01EY031360, R01EY030151 e P30EY026877), dallo Stanford Center for Optic Disc Drusen e dalla ricerca per prevenire la cecità, New York, USA. JW e DR sono supportati dalla VitreoRetinal Surgery Foundation, USA. DR è supportato dalla DARE Fellowship, sponsorizzata dalla Lundbeck Foundation.
0.5ml Tri-coded Tube, 96-format, External Thread | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 68-0703-12 | used for aqueous humor samples |
1 mL syringe | surgical grade, whatever available in hospital | – | for aqueous humor biopsies |
1.9ml Tri-coded Tube, 48-format, External Thread | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 65-7643 | used for vitreous samples |
3 mL syringe | surgical grade, whatever available in hospital | – | for vitreous biopsies |
30-32-gauge needle | surgical grade, whatever available in hospital | – | for aqueous humor biopsies |
Capillary electrophoresis coupled with Fourier transformed mass spectrometry (CE-FTMS) | Human Metabolome Technologies, Inc., Tsuruoka, Japan | – | – |
Constellation vitrectomy system with 23-, 25-, or 27-gauge trocar cannula system | Alcon Laboratories Inc, Fort Worth, TX, USA | – | for vitreous biopsies |
Cooling box | Standard styrofoam box, whatever available in lab | – | – |
Dry ice | Whatever available in lab | – | – |
Handsfree Standard Range Scanner Kit with Shielded USB Cable | Zebra Symbol | DS9208-SR4NNU21Z | Barcode scanner |
Human Glycosylation Antibody Array L3 | RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA | GAH-GCM-L3 | – |
Mac mini | Apple Inc., Cupertino, CA 95014, USA | – | – |
MetaboAnalyst software | Pang et al., 2021, PMID: 34019663 | – | – |
Rack for 0.5ml tubes, 96-Format | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 66-51026 | for aqueous humor samples |
Rack for 1.9ml tubes, 48-Format | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 65-9451 | for vitreous samples |
REDCap browser-based sample database | REDCap Consortium, Vanderbilt University, https://www.project-redcap.org | – | – |