JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
português

Automatically Generated
Medicine

Biobanco de biópsias humanas aquosas e vítreas líquidas para análises moleculares

Published: September 11, 2023
doi:
10.3791/65804
, , , , , , , , , , ,
1Molecular Surgery Laboratory,Stanford University, 2Department of Ophthalmology, Byers Eye Institute,Stanford University, 3Department of Ophthalmology and Visual Neurosciences,University of Minnesota, 4Retina Consultants of Minnesota, 5Department of Pediatrics,University of Iowa, 6Department of Neurology,University of Iowa, 7The Iowa Neuroscience Institute (INI),University of Iowa, 8Department of Physiology and Pharmacology, Cumming School of Medicine,University of Calgary, 9Department of Biochemistry and Molecular Biology, Cumming School of Medicine,University of Calgary, 10Veterans Affairs Palo Alto Health Care System

Summary

Este protocolo apresenta uma plataforma integrada de biorrepositório para coleta, anotação e biobanco padronizados de biópsias de humor aquoso humano e vítreo líquido de alta qualidade para análises moleculares a jusante, incluindo proteômica, metabolômica e glicômica.

Abstract

Um desafio crítico na pesquisa translacional é estabelecer uma interface viável e eficiente entre o atendimento ao paciente na sala de cirurgia (SO) e o laboratório de pesquisa. Neste trabalho, desenvolvemos um protocolo para aquisição de biópsias líquidas de alta qualidade para análises moleculares a partir do humor aquoso e vítreo de pacientes submetidos à cirurgia ocular. Nesse fluxo de trabalho, um carrinho MORLI (Mobile Operating Room Lab Interface) equipado com um computador, um scanner de código de barras e instrumentos de laboratório, incluindo armazenamento a frio a bordo, é usado para obter e arquivar amostras biológicas humanas. Um banco de dados baseado na Web compatível com a privacidade de dados permite anotar cada amostra ao longo de sua vida útil, e um sistema de coordenadas cartesianas permite rastrear cada amostra com código de barras em armazenamento, permitindo a recuperação rápida e precisa de amostras para análises downstream. A caracterização molecular de amostras de tecido humano não serve apenas como uma ferramenta diagnóstica (por exemplo, para distinguir entre endoftalmite infecciosa e outra inflamação intraocular não infecciosa), mas também representa um componente importante da pesquisa translacional, permitindo a identificação de novos alvos de drogas, o desenvolvimento de novas ferramentas diagnósticas e terapêuticas personalizadas.

Introduction

O perfil molecular de biópsias líquidas do olho humano pode capturar fluidos localmente enriquecidos contendo moléculas como DNA, RNA, proteínas, glicanos e metabólitos de tecidos oculares altamente especializados. Biópsias líquidas do vítreo na câmara posterior do olho humano mostraram-se um procedimento geralmente seguro1. Permitem a caracterização molecular de doenças oculares em seres humanos vivos e oferecem o potencial para identificar novas estratégias diagnósticas e terapêuticas2,3,4. O humor aquoso na câmara anterior do olho tem acessibilidade cirúrgica ainda maior e pode ser obtido em grande número, por exemplo, durante a cirurgia de catarata, que é uma das cirurgias mais realizadas. No entanto, nenhum protocolo padronizado para coleta, anotação e biobanco de biópsias de humor aquoso humano e líquido vítreo para análises moleculares a jusante, incluindo proteômica, metabolômica e glicômica, está disponível até o momento.

Aqui, desenvolvemos um protocolo para coleta e biobanco de biópsias líquidas de alta qualidade para análises moleculares de pacientes submetidos à cirurgia ocular. Uma Interface de Laboratório de Sala de Operação Móvel (MORLI) permite que um pesquisador congele imediatamente as amostras coletadas em criofrais com código de barras em gelo seco a -80 °C na sala de cirurgia (SO). Este procedimento garante uma qualidade de amostra alta e consistente para análise molecular a jusante. Além da excelente qualidade das amostras, a anotação precisa das amostras em um biobanco é fundamental. Usandoum banco de dados REDCap (captura eletrônica de dados de pesquisa) 5 compatível com HIPAA (Health Insurance Portability and Accountability Act) baseado na Web, nosso fluxo de trabalho permite o armazenamento de metadados detalhados para cada amostra, incluindo idade, sexo, doença, estágio da doença, tipo de amostra e características exclusivas da cirurgia. Isso permitirá uma capacidade de busca futura precisa, por exemplo, para amostras de uma doença específica ou de um grupo específico de pacientes. Além disso, a localização exata de cada amostra no freezer é arquivada usando um sistema de grade cartesiana, que permite a recuperação eficiente de amostras para experimentos a jusante. Mostramos exemplos de análises de DNA, proteínas, glicanos e metabólitos.

Nosso fluxo de trabalho representa uma conexão prática e eficaz entre a sala de cirurgia e o laboratório de pesquisa e fornece uma base valiosa para a pesquisa translacional.

Protocol

O protocolo segue as diretrizes do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos (CEP) da Universidade de Stanford, EUA. ATENÇÃO: Este protocolo é um guia para cirurgiões oftalmológicos qualificados. No contexto de neoplasias intraoculares, a disseminação de tumor extraocular no contexto de humor aquoso ou biópsias líquidas vítreas não pode ser descartada. No entanto, o risco de extensão extraocular e envolvimento orbitário é extremamente baixo na biópsia transvítrea de tumor de coroide, que é feita de forma reforçada em segurança e com consideração cuidadosa do sítio deentrada6. Este protocolo não abrange e pode ser contraindicado em casos de retinoblastoma ou tumores com alto risco metastático. 1. Antes da coleta da amostra Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa Obter as aprovações do CEP local antes do início do experimento e realizar a coleta de amostras de acordo. População de estudo Critérios de inclusão: Incluir todos os pacientes (0 a 99 anos) submetidos à cirurgia intraocular na instituição que disponibilizará uma quantidade adequada de humor aquoso ou líquido vítreo superior à necessária para testes diagnósticos adequados para avaliar a condição do paciente e os pacientes que desejam participar. Critérios de exclusão: Excluir pacientes que se recusam a participar e gestantes. Consentimento informado Obter consentimento informado por escrito de cada paciente seguindo o protocolo aprovado pelo IRB. Arquive o consentimento assinado em um banco de dados seguro. Treinar o pessoal envolvido (cirurgiões, técnicos de laboratório, pessoal da sala de cirurgia (SO), cientistas) conforme descrito neste protocolo. Configure um banco de dados de gerenciamento de exemplo. Use o REDCap como um banco de dados de amostra baseado na Web compatível com HIPAA projetado para oferecer suporte à captura de dados para estudos de pesquisa5.Observação : este artigo descreve o uso da interface baseada na Web fornecida pelo REDCap para criar formulários, definir campos, configurar lógica de ramificação e aplicar regras de validação de dados sem a necessidade de amplo conhecimento de programação. Alternativamente, outros softwares, como aplicativos de planilha padrão, também podem ser adequados. Garantir a disponibilidade de uma caixa de refrigeração, gelo seco, seringa para coleta de amostras e criovials (consulte a Tabela de Materiais). Use criósforos com códigos de barras que são gravados permanentemente nos frascos. Isso elimina a necessidade de adicionar identificadores de paciente no frasco e a possibilidade de perder um rótulo em condições de congelamento. Avise o cirurgião sobre o caso e o técnico de laboratório que ajudará na coleta da amostra na SO pelo menos 24 h antes da cirurgia programada. 2. Aquisição de peças cirúrgicas no centro cirúrgico Interface móvel de laboratório de centro cirúrgico (MORLI) Estabeleça um MORLI na sala de cirurgia. O MORLI inclui uma superfície plana de bancada de laboratório, um computador/tablet com um scanner de código de barras com acesso ao banco de dados REDCap e uma caixa de resfriamento com gelo seco (consulte a Tabela de Materiais).CUIDADO: O gelo seco é extremamente frio. Use sempre luvas ao manusear gelo seco e evite tocá-lo. Preparo da coleta de amostras na SO Faça login no computador/tablet no MORLI e abra o banco de dados REDCap. Verifique se o consentimento informado foi assinado pelo paciente e confirme isso com o cirurgião. Lembre-o de que é necessária uma amostra não diluída. Use luvas. Obter o número adequado de criósculos com código de barras (0,5 mL para humor aquoso e 1,9 mL para amostras vítreas) e colocá-los onde sejam de fácil acesso. Coleta de biópsias líquidas de humor aquosoCUIDADO: Considere amostras de tecido humano como material bioperigoso, o que requer precauções apropriadas, como jaleco e luvas para garantir a segurança do pessoal envolvido.NOTA: Os passos a seguir só devem ser realizados por um cirurgião oftalmológico treinado. Biópsias aquosas de humor líquido podem ser obtidas, por exemplo, no início da cirurgia de catarata, uma das cirurgias mais frequentes em todo o mundo.NOTA: Um campo estéril é mantido de acordo com os protocolos de cuidados padrão na sala de cirurgia. Os procedimentos pré-operatórios relacionados à anestesia do paciente seguem as etapas padrão de cuidados para cirurgias de câmara anterior e vitreorretinianas.Prepare e esfregue o olho para a cirurgia e coloque um espéculo de pálpebra estéril para visualização ideal do campo estéril. Use um microscópio cirúrgico para realizar uma paracentese da câmara anterior perpendicular ao limbo usando uma agulha 30-32 G conectada a uma seringa de 1 mL. Use uma ponta de algodão ou pinça pequena para estabilizar o olho durante este procedimento.NOTA: Certifique-se de que a agulha e a seringa estão bloqueadas e que não há pressão na seringa (movendo o êmbolo). Certifique-se de que a ponta da agulha permaneça sobre a íris periférica na câmara médio-anterior para evitar danos às estruturas intraoculares. No caso da cirurgia de catarata, a agulha para obter a biópsia líquida também pode entrar na câmara anterior através de uma das paracenteses que são criadas para a cirurgia de catarata. Sob visualização direta ao microscópio, aspirar manualmente aproximadamente 100 μL de humor aquoso não diluído usando uma seringa de 1 mL. Mova o êmbolo da seringa com a mão não dominante do cirurgião ou por um assistente treinado sem mover a agulha.NOTA: Obter menos de 100 μL de humor aquoso caso a câmara anterior entre em colapso. Retire cuidadosamente a agulha da câmara anterior.NOTA: Em um olho fácico, mantenha a agulha sobre a íris para evitar tocar na lente. A pressão positiva sobre o globo ocular pode aumentar o refluxo. Soltar a ponta do algodão antes que a agulha seja retirada ajuda a reduzir o refluxo. Puxe o êmbolo para trás e veja como o ar e o fluido coletado estão se movendo. Injete a seringa no criovial. O ar extra limpa o espaço morto da seringa. Use o código de barras no criovial para digitalizar a amostra para o formulário REDCap em um computador na sala de cirurgia (mais detalhes nas etapas 3.1 a 3.9). Transfira imediatamente o criovial para gelo seco na caixa de resfriamento. Continue com a cirurgia programada para o paciente (por exemplo, uma cirurgia de catarata como descrito anteriormente7 ). Coleta de biópsias de líquido vítreoNOTA: Os passos a seguir só devem ser realizados por um cirurgião vitreorretiniano treinado. Biópsias vítreas líquidas podem ser obtidas no início de uma vitrectomia8. Como o objetivo é coletar uma amostra vítrea não diluída, o cortador de vitrectomia não será preparado com líquido1.NOTA: Um campo estéril é mantido de acordo com os protocolos de cuidados padrão na sala de cirurgia. Os procedimentos pré-operatórios relacionados à anestesia do paciente seguem as etapas padrão de cuidados para cirurgias de câmara anterior e vitreorretinianas.Prepare e esfregue o olho para a cirurgia e coloque um espéculo de pálpebra estéril para visualização ideal do campo estéril. Criar esclerotomias com cânula de trocarte 23, 25 ou 27 G, seguindo os procedimentos padrão de tratamento. Insira a cânula de infusão e confirme visualmente o posicionamento adequado na cavidade vítrea. Na cavidade vítrea, ative o cortador vítreo sem infusão para coletar uma amostra vítrea não diluída. Aspirar manualmente 0,5 a 1,0 mL de vítreo com seringa conectada à cânula de extrusão vítrea1. Retire o cortador vítreo do olho e ligue a infusão de líquido. Aspirar o líquido restante dentro da tubulação para a seringa. Desconecte a seringa. Processar a amostra conforme descrito para uma amostra de humor aquoso na secção 2.3 (passo 2.3.5 a passo 2.3.9). 3. Processamento de amostras na SO e adição de amostras ao banco de dados Peça ao técnico de laboratório para pegar o criovial preparado (0,5 mL para humor aquoso e 1,9 mL para amostras vítreas) e caminhar até o cirurgião sem tocar em nenhum equipamento estéril de SO. Peça ao técnico de laboratório para abrir o criovial. Descarregue a seringa diretamente no criovial. Peça ao técnico de laboratório para recapitular imediatamente o criovial. Peça ao técnico de laboratório para voltar ao MORLI e transferir imediatamente a amostra para gelo seco na caixa de resfriamento (-80 °C). Feche a tampa da caixa. Abra um novo formulário de coleta de amostras. Insira as seguintes informações no respectivo campo do formulário: cirurgião do caso, local e data da coleta, número identificador do paciente e outras informações básicas, como idade, sexo, olho direito ou esquerdo, diagnóstico, história pré-operatória (texto livre), informações sobre o procedimento (por exemplo, tipo de cirurgia), bem como informações sobre as amostras, como número de amostras coletadas, tipo de amostras (humor aquoso, vítreo) e outros detalhes, como volumes. Adicione o código de barras do tubo usando o scanner de código de barras. Clique em Enviar/Avançar. Repita as etapas 3.1 a 3.7 se forem coletadas amostras adicionais. Quando todas as amostras estiverem protegidas, clique em Salvar e enviar no formulário de coleta de amostras REDCap. Em seguida, faça logout do banco de dados e do computador/tablet. 4. Transferência de crióvios para armazenamento Transporte as amostras em gelo seco na caixa de resfriamento da sala de cirurgia para o laboratório e coloque-as em uma bancada de laboratório ao lado de um computador de laboratório. Faça login no REDCap no computador do laboratório usando seu ID de login e senha. Use luvas. Pegue uma das amostras coletadas e digitalize o código de barras do criovial no banco de dados (mais detalhes na seção 5). Coloque imediatamente a amostra de volta no gelo seco. Obtenha um segundo recipiente cheio de gelo seco. Obtenha um rack para os crióssils do congelador de -80 °C. Coloque no segundo recipiente sobre gelo seco.NOTA: Um rack de formato 96 será necessário para os tubos de humor aquoso de 0,5 mL e um rack de formato 48 para os tubos vítreos de 1,9 mL. Digitalize o código de barras do rack para o banco de dados (mais detalhes na seção 5). Transfira a amostra para o rack. Adicione a posição dos frascos para injetáveis no rack à base de dados (mais detalhes na secção 5). Clique em Salvar e enviar. Transporte o rack com os frascos para injetáveis em gelo seco para o frigorífico para armazenamento a -80 °C. Adicione o rack a uma posição específica na geladeira usando um sistema de coordenadas. Isso permitirá mais tarde recuperar amostras para análise a jusante facilmente. 5. Formulário de armazenamento da amostra Preencha um formulário de armazenamento para cada amostra coletada durante a fase de formulário de entrada. Clique no círculo vazio ou no “+” em Armazenamento de amostra para criar e abrir um novo formulário de armazenamento. Insira a data em que este formulário foi preenchido em Data de arquivamento do registro. Digitalize ou digite o código de barras do tubo em Código de barras do tubo da amostra. Coloque imediatamente a amostra de volta no gelo seco. Selecione se uma amostra é transferida para fora ou se a amostra está indo para o armazenamento interno do biorrepositório. Verifique se o consentimento informado por escrito foi obtido do paciente e selecione a caixa em Verificar conformidade do consentimento e insira seu nome em Consentimento verificado por. Selecione um local livre e adequado para o criovial no rack. Transfira o criovial nessa posição para o rack (por exemplo, posição A1). Mantenha a cremalheira no gelo seco. Na fase Localização, insira as seguintes informações: a localização do freezer em Freezer, o número da prateleira onde a amostra será armazenada em Shelf, o código de barras da caixa em Box Barcode, a posição do tubo na caixa por linha (Posição do tubo (Row)) e a coluna (Tube Position (Column)).NOTA: Opcionalmente, uma etiqueta de caixa também pode ser inserida em Etiqueta de caixa, o que pode facilitar a localização da caixa no congelador. Na seção Uso , insira as seguintes informações: o nome do projeto para o qual a amostra é usada (Nome do projeto), o volume da amostra em uma das seguintes categorias: cheio, parcial, quase vazio ou vazio (Volume da amostra) e notas de armazenamento, se aplicável, em Notas de armazenamento.Observação : a data, hora e usuário que acessou o formulário pela última vez é preenchido automaticamente para garantir uma cadeia de custódia que pode ser revisada e auditada conforme necessário. Confirme se o formulário foi preenchido clicando em Concluir em Concluir?. Clique em Salvar & Sair do formulário. Isso o levará de volta à visão geral do paciente. Para cada tubo coletado, gere outro formulário de coleta de amostra clicando no “+” em Armazenamento de amostras. Em seguida, repita as etapas 5.1 a 5.10. Clique em Salvar e Sair para preencher o formulário e fazer logout do banco de dados e do computador/tablet. Transfira o rack de amostras (em gelo seco) para o frigorífico na posição pré-especificada. 6. Recuperação de peças cirúrgicas para análise a jusante NOTA: Os espécimes são frequentemente arquivados por vários anos antes de serem analisados. Os crióvios com código de barras e o sistema de banco de dados REDCap pesquisável permitem encontrar e localizar cada amostra facilmente para análise a jusante. Identifique amostras de interesse para o experimento usando a função de busca do banco de dados. Isso permitirá encontrar, por exemplo, todas as amostras de humor aquoso de pacientes entre 20 e 40 anos com retinopatia diabética. Obter a localização dos crióvios de interesse (congelador, prateleira/rack, rack de amostras, coordenadas dentro do rack). Anote-os, imprima-os ou disponibilize-os em um computador/tablet móvel para facilitar a localização das amostras no freezer. Marque os exemplos como usados no banco de dados. Clique em Salvar e Sair para preencher o formulário e fazer logout do REDCap e do computador/tablet.

Representative Results

Os espécimes de biópsia líquida coletados podem ser submetidos a uma variedade de análises moleculares, incluindo a análise de DNA, proteínas, glicanos e metabólitos. Já foi demonstrado anteriormente que o armazenamento de longo prazo por vários anos a -70 °C não afetou significativamente a integridade do perfil proteômico9. O banco de dados REDCap permite a recuperação simples e rápida de amostras. O banco de dados pode ser pesquisado em busca de amostras de um grupo específico de pacientes, por exemplo, todos os pacientes com retinopatia diabética. O banco de dados fornecerá então os códigos de barras dos tubos e as posições em armazenamento. Até agora, coletamos e arquivamos mais de 1.000 biópsias líquidas. O banco de dados permitiu encontrar rapidamente as amostras para análises a jusante 3,10 e ajudou a realizar os experimentos seguintes. Uma adolescente de 17 anos apresentou inflamação da retina e do nervo óptico. Ela estava imunocomprometida e havia uma preocupação com a infecção. O humor aquoso foi coletado do olho direito e enviado para análise de DNA PCR. Os resultados foram positivos para citomegalovírus e negativos para vírus herpes simples e toxoplasmose. Esses achados ilustram que biópsias líquidas de humor aquoso podem ajudar a distinguir formas infecciosas de não infecciosas de inflamação intraocular, o que é fundamental para selecionar a terapia apropriada. A cromatografia líquida-espectrometria de massas permite uma análise semiquantitativa e imparcial do proteoma. Em biópsia líquida do vítreo de paciente vitrectomia, a técnica foi capaz de identificar 484 proteínas únicas, incluindo Complemento C3 (C3), Óptica (OPTC) e Colágeno Tipo II Alfa 1 (COL2A1) (Figura 1A). Três biópsias vítreas líquidas foram analisadas usando um ELISA multiplex glicoproteômico (ver Tabela de Materiais)11. O ensaio detectou os perfis de glicosilação de 500 proteínas humanas, capturando uma variedade de vias biológicas, como metabolismo, resposta imune, adesão celular e organização da actina (Figura 1B). Uma triagem metabolômica usando eletroforese capilar acoplada à espectrometria de massas com transformada de Fourier12 (ver Tabela de Materiais) identificou 292 metabólitos diferentes em três amostras de biópsia líquida de humor aquoso. Uma análise de vias (ver Tabela de Materiais)13 identificou uma variedade de vias metabólicas, incluindo metabolismo de aminoácidos, ciclo da ureia e síntese de carnitina (Figura 1C). Figura 1: Resultados representativos . (A) A análise proteômica do humor vítreo humano por cromatografia líquida e espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) identificou 484 proteínas únicas em uma única biópsia líquida. Os níveis de proteína são mostrados e classificados com base em contagens espectrais. Proteínas representativas são destacadas em azul. (B) Um ELISA multiplex glicoproteômico detectou níveis de glicosilação de 500 proteínas únicas em três biópsias vítreas líquidas. Uma análise de interação de proteínas STRING identificou clusters de interações proteicas (clusters com pelo menos 10 proteínas são mostrados). O caminho mais significativamente enriquecido é mostrado para cada cluster. (C) A análise metabolômica por espectrometria de massas identificou 292 metabólitos diferentes em três biópsias líquidas de humor aquoso. Cada ponto representa uma amostra. A altura da barra corresponde ao número médio de metabólitos, a barra de erro representa o desvio padrão. O painel direito mostra caminhos significativamente enriquecidos. O número de metabólitos detectados (numerador), bem como o número total de metabólitos em cada via (denominador) são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Espécimes cirúrgicos de pacientes permitem a caracterização molecular direta da doença em seres humanos vivos2,3,4,14 e podem ajudar a superar as limitações de modelos de doenças celulares e animais que não recapitulam totalmente a doença humana 15,16. A análise molecular de tecidos humanos pode melhorar a seleção de novos alvos de fármacos e contribuir para uma maior taxa de sucesso de ensaios clínicos e aprovação de fármacos17. Além disso, essa abordagem oferece o potencial para a medicina personalizada, uma vez que o tecido obtido retém a impressão digital genômica, epigenômica, metabolômica, glicômica e proteômica única de cada indivíduo 2,18,19.

A alta e consistente qualidade da amostra é fundamental para todas as aplicações de análise molecular. Estudos prévios mostraram que o congelamento imediato após a recuperação da amostra e evitar ciclos repetidos de congelamento/descongelamento são críticos para altas qualidades da amostra 9,20. O armazenamento prolongado por vários anos a -70 °C não afetou significativamente a integridade do perfil proteômico9. Um protocolo padronizado é uma base importante para reduzir vieses e melhorar a comparabilidade de dados científicos, especialmente quando várias pessoas (cirurgiões, técnicos e outros) ou diferentes instituições estão envolvidas no processo de amostragem. Além da qualidade da amostra, a anotação das amostras é outro fator importante que requer padronização para permitir a correlação dos achados moleculares com os dados clínicos. Nosso protocolo baseia-se em três princípios essenciais para conseguir isso: 1) um procedimento de amostragem padronizado para biópsias de humor aquoso e líquido vítreo por um cirurgião oftálmico, 2) o processamento imediato e o congelamento instantâneo de amostras na SO pelo pessoal do laboratório e 3) uma anotação de metadados de cada amostra em um banco de dados baseado na web que permite aos pesquisadores encontrar rapidamente amostras para experimentos posteriores.

Além dos espécimesvítreos20, esse fluxo de trabalho também estabelece a coleta padronizada de biópsias líquidas aquosas do humor para análise molecular. O humor aquoso é um líquido complexo e altamente acessível na câmara anterior do olho que não reflete apenas doenças oculares do segmento anterior, mas também do segmento posterior do olho, incluindo doenças retinianas18,21. Juntamente com o fato de que um grande número de amostras de humor aquoso pode ser coletado, por exemplo, durante a cirurgia de catarata, uma das cirurgias mais frequentemente realizadas em todo o mundo, essas características a tornam uma fonte interessante para biópsias líquidas do olho humano. A anotação padronizada de metadados de cada amostra estabelecida neste fluxo de trabalho também poderia permitir a correlação dos dados do proteoma com os dados de seguimento clínico prospectivo. Isso oferece a oportunidade empolgante de identificar novos biomarcadores prognósticos que podem ajudar a estimar o prognóstico de futuros pacientes.

No entanto, a análise molecular de espécimes cirúrgicos humanos também apresenta limitações importantes. Por exemplo, manipulações experimentais complexas muitas vezes só são possíveis em modelos animais e celulares. Uma solução pode ser comparar o perfil molecular de modelos animais ou celulares com o de doenças humanas. Essa estratégia pode identificar biomarcadores proteicos sobrepostos e alvos terapêuticos que podem ser validados em animais ou modelos celulares para identificar os candidatos mais promissores que se correlacionam com a doença humana e provavelmente terão sucesso em ensaios clínicos 4,16.

Em conclusão, nosso fluxo de trabalho estabelece uma interface prática entre o centro cirúrgico e o laboratório de pesquisa que permite coleta, anotação e armazenamento padronizados e de alto rendimento de espécimes cirúrgicos de alta qualidade para análise molecular a jusante, fornecendo uma base valiosa para futuras pesquisas translacionais.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O VBM é apoiado por subsídios do NIH (R01EY031952, R01EY031360, R01EY030151 e P30EY026877), pelo Stanford Center for Optic Disc Drusen e pela Research to Prevent Blindness, Nova York, EUA. TJ e RD são apoiados pela VitreoRetinal Surgery Foundation, EUA. A DR é apoiada pela DARE Fellowship, que é patrocinada pela Fundação Lundbeck.

Materials

0.5ml Tri-coded Tube, 96-format, External Thread Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA 68-0703-12 used for aqueous humor samples
1 mL syringe surgical grade, whatever available in hospital – for aqueous humor biopsies
1.9ml Tri-coded Tube, 48-format, External Thread Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA 65-7643 used for vitreous samples
3 mL syringe surgical grade, whatever available in hospital – for vitreous biopsies
30-32-gauge needle surgical grade, whatever available in hospital – for aqueous humor biopsies
Capillary electrophoresis coupled with Fourier transformed mass spectrometry (CE-FTMS) Human Metabolome Technologies, Inc., Tsuruoka, Japan – –
Constellation vitrectomy system with 23-, 25-, or 27-gauge trocar cannula system Alcon Laboratories Inc, Fort Worth, TX, USA – for vitreous biopsies
Cooling box Standard styrofoam box, whatever available in lab – –
Dry ice Whatever available in lab – –
Handsfree Standard Range Scanner Kit with Shielded USB Cable Zebra Symbol  DS9208-SR4NNU21Z Barcode scanner
Human Glycosylation Antibody Array L3  RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA GAH-GCM-L3 –
Mac mini Apple Inc., Cupertino, CA 95014, USA – –
MetaboAnalyst software Pang et al., 2021, PMID: 34019663 – –
Rack for 0.5ml tubes, 96-Format Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA 66-51026 for aqueous humor samples
Rack for 1.9ml tubes, 48-Format Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA 65-9451 for vitreous samples
REDCap browser-based sample database REDCap Consortium, Vanderbilt University, https://www.project-redcap.org – –
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mishra, K., et al. Intraoperative complications with vitreous biopsy for molecular proteomics. Ophthalmic Surgeries, Lasers Imaging Retina. 54 (1), 32-36 (2023).
  2. Velez, G., Bassuk, A. G., Colgan, D., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Therapeutic drug repositioning using personalized proteomics of liquid biopsies. JCI Insight. 2 (24), (2017).
  3. Velez, G., et al. Liquid biopsy proteomics of uveal melanoma reveals biomarkers associated with metastatic risk. Molecular Cancer. 20 (1), 39 (2021).
  4. Wert, K. J., et al. Metabolite therapy guided by liquid biopsy proteomics delays retinal neurodegeneration. EBioMedicine. 52, 102636 (2020).
  5. Harris, P. A., et al. The REDCap consortium: Building an international community of software platform partners. Journal of Biomedical Informatics. 95, 103208 (2019).
  6. Finn, A. P., Materin, M. A., Mruthyunjaya, P. Choroidal tumor biopsy: A review of the current state and a glance into future techniques. Retina. 38 Suppl 1, S79-S87 (2018).
  7. Tarantola, R. M., Graff, J. M., Somani, R., Mahajan, V. B. Temporal approach for small-gauge pars plana vitrectomy combined with anterior segment surgery. Retina. 32 (8), 1614-1623 (2012).
  8. Mahajan, V. B., et al. Sutureless triplanar sclerotomy for 23-gauge vitrectomy. Archives in Ophthalmology. 129 (5), 585-590 (2011).
  9. Mitchell, B. L., Yasui, Y., Li, C. I., Fitzpatrick, A. L., Lampe, P. D. Impact of freeze-thaw cycles and storage time on plasma samples used in mass spectrometry based biomarker discovery projects. Cancer Informatics. 1 (1), 98-104 (2005).
  10. Velez, G., et al. Proteomic insight into the pathogenesis of CAPN5-vitreoretinopathy. Science Reports. 9 (1), 7608 (2019).
  11. Montgomery, M. R., Hull, E. E. Alterations in the glycome after HDAC inhibition impact oncogenic potential in epigenetically plastic SW13 cells. BMC Cancer. 19 (1), 79 (2019).
  12. Okamoto, N., et al. Comparison of serum metabolomics pathways and patterns between patients with major depressive disorder with and without type 2 diabetes mellitus: An exploratory study. Journal of Integrated Neuroscience. 22 (1), 13 (2023).
  13. Pang, Z., et al. MetaboAnalyst 5.0: narrowing the gap between raw spectra and functional insights. Nucleic Acids Research. 49 (W1), W388-W396 (2021).
  14. Wolf, J., et al. The Human Eye Transcriptome Atlas: A searchable comparative transcriptome database for healthy and diseased human eye tissue. Genomics. 114 (2), 110286 (2022).
  15. Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110 (9), 3507-3512 (2013).
  16. Wolf, J., et al. Comparative transcriptome analysis of human and murine choroidal neovascularization identifies fibroblast growth factor inducible-14 as phylogenetically conserved mediator of neovascular age-related macular degeneration. Biochimca et Biophysica Acta Molecular Basis of Diseases. 1868 (4), 166340 (2022).
  17. Dowden, H., Munro, J. Trends in clinical success rates and therapeutic focus. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (7), 495-496 (2019).
  18. Li, H. T., et al. Characterizing DNA methylation signatures of retinoblastoma using aqueous humor liquid biopsy. Nature Communication. 13 (1), 5523 (2022).
  19. Velez, G., et al. Personalized proteomics for precision health: identifying biomarkers of vitreoretinal disease. Translational Vision Science and Technology. 7 (5), 12 (2018).
  20. Skeie, J. M., et al. A biorepository for ophthalmic surgical specimens. Proteomics Clin Applications. 8 (3-4), 209-217 (2014).
  21. Rinsky, B., et al. Analysis of the aqueous humor proteome in patients with age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 62 (10), 18 (2021).

Tags

BiobankingLiquid BiopsyAqueous HumorVitreousMolecular ProfilingOcular DiseaseDiagnosticTherapeuticStandardized CollectionData PrivacyBarcodeSample RetrievalProtein AnalysisGlycan AnalysisMetabolite AnalysisAnterior Chamber ParacentesisPhakic EyeVitrectomyVitreoretinal SurgeonUndiluted Sample

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wolf, J., Chemudupati, T., Kumar, A., Rasmussen, D. K., Wai, K. M., Chang, R. T., Montague, A. A., Tang, P. H., Bassuk, A. G., Dufour, A., Mruthrunjaya, P., Mahajan, V. B. Biobanking of Human Aqueous and Vitreous Liquid Biopsies for Molecular Analyses. J. Vis. Exp. (199), e65804, doi:10.3791/65804 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image