יישום של Ha-CoV-2 Pseudovirus לכימות מהיר של גרסאות SARS-CoV-2 ונוגדנים מנטרלים

1. הרכבת וירוסים וחלקיקים נגיפיים וקטורים: רכישת וקטורי ביטוי עבור SARS-CoV-2 M, E או N וכן עבור SARS-CoV-2 S (סוג פראי, Wt), דלתא (B.1.617.2) ואומיקרון (B.1.1.529) באופן מסחרי.הערה: רצפי חלבונים של וקטורי הביטוי מופיעים בקובץ משלים 1. את הספק של וקטורי ביטוי אלה ניתן למצוא גם תחת טבלת החומרים. תאים ותרבית תאים: לשמור על HEK293T תאים בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) המכיל 10% סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS), 50 יחידות / מ”ל פניצילין, ו 50 מיקרוגרם / מ”ל של סטרפטומיצין.הערה: כל עבודת תרבית התאים צריכה להיעשות בארון בטיחות ביולוגית למינרי של זרימת אוויר. טרנספקציית פוליאתילנימין (PEI) דורשת בדרך כלל דגירה של 5-6 שעות. יש לשקול היטב את זמני ההתחלה מראש. הרכבת וירוסים וקוטרנספקציה מבוססת PEI: הרכבת חלקיקי Ha-CoV-2 על ידי קוטרנספקציה של תאי HEK293T. תאי זרעים בצלחת פטרי תרבית תאים בקוטר 10 ס”מ (4-5 x 10,6 תאים לצלחת) ב-10 מ”ל של מדיום DMEM שלם ביום שלפני הטרנספקציה. במחקר זה, שלוש צלחות פטרי משמשות לזרע תאים להרכבת Ha-CoV-2 מסוג בר, דלתא ואומיקרון, בהתאמה. לדגור צלחות פטרי לילה באינקובטור CO2 ב 37 ° C. בדקו את הכלים למחרת בבוקר כדי לוודא שהתאים נפגשים ב-80%. הסר את המדיום המלא והחלף אותו ב- 9 מ”ל של מדיה ללא סרום DMEM. עבור כל מנה, הכינו תערובת קוטרנספקציה עם 2.5 מיקרוגרם של כל אחד מווקטורי ביטוי החלבונים המבניים של SARS-CoV-2 (N, E, M), 10 מיקרוגרם pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (גנום HaCoV2), ו-2.5 מיקרוגרם של וקטור ביטוי חלבון S, גרסאות דלתא או אומיקרון S ו-45 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה מבוסס PEI. אפשר לתערובת cotransfection ליצור קומפלקסים על ידי דגירה במשך 13 דקות (לא לדגור במשך יותר מ 30 דקות). לאחר הדגירה, מוסיפים את תערובת הקוטרנספקציה לכל צלחת פטרי לאט, טיפה אחר טיפה. מניחים את הכלים בתוך אינקובטור CO2 ב 37 ° C במשך 6 שעות. לאחר 6 שעות, הסר DMEM ללא סרום והחלף אותו במדיום DMEM מלא. וירוס הקציר ב 48-60 שעות לאחר cotransfection. קצירת וירוסים ואחסונם: קציר חלקיקים ב 48 שעות לאחר cotransfection. נתק תאים על ידי צנרת שוב ושוב על פני השטח של monolayer ולאסוף תאים מכל צלחת, לשים לתוך צינורות צנטריפוגה 15 מ”ל, וצנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות. אספו את הסופרנאטנט והעבירו אותו דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר. אחסן את הפסאודו-וירוס Ha-CoV-2 ב -80 °C. 2. בדיקת הדבקה ויראלית תאים ותרבית תאים: לשמור על HEK293T (ACE2/TMPRSS2) תאים בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) המכיל 10% FBS מומת חום, 50 יחידות / מ”ל של פניצילין ו 50 מיקרוגרם / מ”ל של סטרפטומיצין. זריעת תאי HEK293T(ACE2/TMPRSS2): יום לפני בדיקת ההדבקה הנגיפית, זרעו תאי HEK293T(ACE2/TMPRSS2) בצלחת של 96 בארות במדיית DMEM מלאה של 50 מיקרוליטר. עבור כל צלחת 96 בארות, זרעו 2.5 x 104 תאים לתוך כל באר, ובסך הכל 2.5 x 106 תאים נדרשים עבור צלחת אחת. הניחו את צלחת הבאר 96 באינקובטור CO2 ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. זיהום של HEK293T(ACE2/TMPRSS2): השתמש בחלקיקי גרסאות Ha-CoV-2 כדי להדביק תאי HEK293T(ACE2/TMPRSS2). בבוקר ההדבקה, להסיר 50 μL של DMEM מן מראש זרע 96 צלחת באר. החלף מדיה עם 50 μL של Ha-CoV-2 Wild-type, דלתא, או אומיקרון במשך 18 שעות ב 37 ° C.הערה: ניתן לעצור את הפרוטוקול כאן עד שהזיהום הגיע ל -18 שעות של דגירה והצלחת מוכנה לניתוח באמצעות בדיקת לוציפראז. הצלחת הזיהום נקבעת על ידי בדיקת לוציפראז הנובעת מגן הכתב לוציפראז המתבטא בתאים הנגועים, ולכן ככל שמופק יותר אות, כך ההדבקה של וריאנט Ha-CoV-2 מוצלחת יותר. בדיקת Luciferase: לאחר 18 שעות של דגירה, להוסיף 7.5 μL של חיץ ליזה התא ישירות לכל באר ולערבב על ידי טלטול אורביטלי במשך 2 דקות. תאי ליז בחיץ ליזיס למשך 5 דקות לפחות בטמפרטורת החדר. הכן את תמיסת בדיקת Firefly luciferase על ידי ערבוב תמיסת D-luciferin עם תמיסת הבדיקה Firefly luciferase ביחס של 1:50. לקבלת צלחת שלמה של 96 בארות, שלב 3 מ”ל של תמיסת מצע לוציפראז עם 60 מיקרוליטר של תמיסת D-luciferin עם 2940 μL של תמיסת החיץ Firefly luciferase. הוסף 25 μL של תמיסת הבדיקה Firefly luciferase לליזטים התא וערבב את הצלחת על ידי ניעור אורביטלי במשך דקה אחת. נתח את פעילות luciferase באמצעות קורא microplate לוציפראז מסחרי. 3. מיצוי RNA של Ha-CoV-2 ו- PCR כמותי של שעתוק לאחור (RT-qPCR) מיצוי RNA נגיפי: יש לחלץ את ה-RNA הנגיפי מחלקיקי ה-Ha-CoV-2 Wild-type ומחלקיקי ה-Ha-CoV-2 Delta ו-Omicron באמצעות ערכת מיצוי RNA נגיפית מסחרית, בהתאם להוראות היצרן. אחסן את הרנ”א הנגיפי שחולץ בטמפרטורה של -80°C או השתמש בו מיד עבור RT-qPCR. RT-qPCR: בצעו RT-qPCR על RNA נגיפי באמצעות תערובת מאסטר חד-שלבית. בצע את התגובה במכשיר PCR מסחרי. שימו לב כי יעד ההגברה הוא ה-RNA הגנומי של Ha-CoV-2. השתמש ב- DNA וקטורי Ha-CoV-2 כתקן ליצירת עקומה סטנדרטית ולחישוב מספר העתק ה- RNA של כל גרסה. 4. בדיקת נוגדנים מנטרלים זריעה HEK293T(ACE2/TMPRSS2) תאים: יום לפני הבדיקה, זרעו HEK293T תאים (ACE2/TMPRSS2) בצלחת באר 96 ב 50 μL של מדיה DMEM מלאה. תאי HEK293T(ACE2/TMPRSS2) נרכשים באופן מסחרי. לספירת תאים, השג 20 תאי μL מבקבוק T75 המכיל תאי HEK293T(ACE2/TMPRSS2), וערבב עם 20 μL של תמיסת טריפאן כחולה. הוסף 20 μL של תערובת זו לתא ספירת התאים וספור את מספר התאים למ”ל. כדי לזרוע צלחת 96 באר לזיהום, להשתמש 2.5 x 104 תאים לכל באר, ו 2.5 x 106 תאים יהיה צורך בסך הכל. מניחים צלחת באר 96 באינקובטור CO2 ב 37 ° C למשך הלילה. בדיקת נוגדנים מנטרלים: בפלטת פוליפרופילן סטרילית בעלת 96 בארות, מכינים את הנוגדן המנטרל הסטנדרטי 27BV ואת תערובת Ha-CoV-2. הוסף 8 μL של 27BV (45 מ”ג / מ”ל) לצלחת ובצע דילולים סדרתיים של הנוגדן עם 6 μL של DMEM ללא סרום.הערה: הקפד להחליף קצוות פיפטה בין העברות באר וודא שהמדיום נטול הנוגדנים והסרום מעורבבים היטב כדי להפיק תוצאות מדויקות. לנוגדן המדולל סדרתי, להוסיף 54 μL של חלקיק Ha-CoV-2 ולערבב את הנגיף ואת הנוגדן. טרום דגירה של חלקיקי Ha-CoV-2 עם 27BV בדילול סדרתי למשך שעה אחת ב-37°C ב-5% CO2. לאחר הדגירה של 1 שעות, יש למרוח 50 μL של הנוגדן ותערובת Ha-CoV-2 על צלחת 96 בארות המכילה את תאי HEK293T(ACE2/TMPRSS2) (2.5 x 104 תאים לכל באר) שנזרעו יום קודם. עבור בקרות, השאר לפחות שלוש בארות המכילות רק את תאי HEK293T(ACE2/TMPRSS2). הוסף 50 μL של תווך שלם לבארות אלה כדי לשמש בארות לא נגועות עבור אות רקע של קריאות בדיקת לוציפראז.הערה: ניתן לעצור את הפרוטוקול כאן עד שהזיהום יגיע ל -18 שעות של דגירה ב -37 מעלות צלזיוס, ואז הצלחת מוכנה לניתוח באמצעות בדיקת לוציפראז. בדיקת לוציפראז: לאחר 18 שעות של דגירה, יש להוסיף 7.5 מיקרוליטר של חיץ ליזיס ישירות לכל באר ולערבב על ידי טלטול אורביטלי במשך 2 דקות. תאי ליז בחיץ ליזיס למשך 5 דקות לפחות בטמפרטורת החדר. הכן את תמיסת בדיקת Firefly luciferase על ידי ערבוב תמיסת D-luciferin עם תמיסת הבדיקה Firefly luciferase ביחס של 1:50. לקבלת צלחת שלמה של 96 בארות, שלב 3 מ”ל של תמיסת מצע luciferase עם 60 μL של תמיסת D-luciferin עם 2940 μL של תמיסת חיץ luciferase גחלילית. הוסף 25 μL של תמיסת הבדיקה Firefly luciferase לליזטים התא וערבב את הצלחת על ידי ניעור אורביטלי במשך דקה אחת. נתח את פעילות luciferase באמצעות קורא microplate לוציפראז מסחרי. 5. כימות וניתוח סטטיסטי איסוף נתונים: בצעו בדיקות זיהום ולוציפראז בטריפליקט כפי שמצוין (איור 1). כמת ביטוי luciferase עם קריאות assay luciferase. הממוצע הוא הערך הממוצע של שלוש קריאות בדיקת לוציפראז. קריאות אות אות רקע מבארות לא נגועות מופחתות מערך ממוצע זה. סטיית תקן (SD) נקבעת מהערך הממוצע של קריאות בדיקת לוציפראז. ניתוח נתונים: התווה פעילות נטרול נוגדנים וחשב את ערכי ID50 (מינון עיכוב של 50%) באמצעות תוכנת גרפים מסחרית. ערך ID50 מוגדר כדילול מעכב נוגדנים שבו מושגת הפחתה של 50% בזיהום של תאי HEK293T(ACE2/TMPRSS2) (בהתבסס על קריאות בדיקת לוציפראז).