Este protocolo describe la aplicación de un nuevo pseudovirus híbrido alfavirus-SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2) como plataforma para la cuantificación rápida de la infectividad de las variantes del SARS-CoV-2 y su sensibilidad a los anticuerpos neutralizantes.
La pandemia de enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) ha puesto de manifiesto la necesidad de realizar ensayos rápidos para medir con precisión la infectividad de las variantes emergentes del SARS-CoV-2 y la eficacia de los anticuerpos neutralizantes inducidos por la vacuna contra las variantes virales. Estos ensayos son esenciales para la vigilancia de la pandemia y la validación de vacunas y refuerzos específicos de variantes. Este manuscrito demuestra la aplicación de un nuevo pseudovirus híbrido alfavirus-SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2) para la cuantificación rápida de la infectividad de la variante del SARS-CoV-2 y los anticuerpos neutralizantes inducidos por la vacuna contra las variantes virales. El Ha-CoV-2 es una partícula similar al virus SARS-CoV-2 que consta de proteínas estructurales virales (S, M, N y E) y un genoma de ARN de expresión rápida derivado de un alfavirus, el virus del bosque de Semliki (SFV). El Ha-CoV-2 también contiene genes de proteína fluorescente verde (GFP) y de luciferasa que permiten una rápida cuantificación de la infectividad viral. A modo de ejemplo, se cuantifica la infectividad de las variantes Delta del SARS-CoV-2 (B.1.617.2) y Ómicron (B.1.1.529), y también se mide su sensibilidad a un anticuerpo neutralizante (27VB). Estos ejemplos demuestran el gran potencial del Ha-CoV-2 como plataforma robusta para la cuantificación rápida de variantes del SARS-CoV-2 y su susceptibilidad a los anticuerpos neutralizantes.
Hasta mayo de 2023, se habían registrado más de 766 millones de casos de COVID-191. A pesar de las campañas mundiales de vacunación, el SARS-CoV-2 circula continuamente e infecta a las personas, en gran parte debido a la aparición de nuevas variantes como Delta (B.1.617.2) y Ómicron (B.1.1.529) que impulsan nuevas olas de infección 2,3,4. Dado que el SARS-CoV-2 está en constante evolución, es importante desarrollar ensayos rápidos que puedan medir con precisión la infectividad de las variantes emergentes y la eficacia de los anticuerpos neutralizantes inducidos por la vacuna contra estas variantes. Estos ensayos son esenciales para la vigilancia de la pandemia y para determinar la eficacia de las vacunas y sus refuerzos específicos para cada variante.
Debido a la naturaleza altamente contagiosa del SARS-CoV-2, el Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC, por sus siglas en inglés) exige que el estudio del SARS-CoV-2 y sus variantes se realice en instalaciones de nivel de bioseguridad (BSL) 3 5,6. Este requisito de BSL-3 limita el uso de virus vivos para cuantificar la infectividad de las variantes virales y sus anticuerpos neutralizantes en laboratorios clínicos y de investigación comunes. Además, los ensayos tradicionales de neutralización del SARS-CoV-2, como los ensayos basados en el efecto de la placa o del efecto citopático que utilizan virus vivos competentes para la replicación, requieren mucho tiempo y largos períodos de incubación7. Se han desarrollado varios pseudovirus del SARS-CoV-2 pseudotipados con proteína de la espícula (S) para cuantificar la eficacia de los anticuerpos neutralizantes 8,9,10,11,12. En el SARS-CoV-2, la proteína S es la principal proteína que media la entrada viral13 y es el principal antígeno utilizado en las vacunas contra el SARS-CoV-2 9,10,14,15,16. Los viriones pseudotipados de proteína S, como los del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G) o lentivirus, se han utilizado para la cuantificación de anticuerpos neutralizantes 17,18,19. Sin embargo, el pseudovirus basado en lentivirus normalmente requiere de 2 a 3 días de infección para cuantificar las señales indicadoras. Los sistemas de pseudovirus basados en VSV a menudo contienen virus VSV residuales, lo que puede dar lugar a altas tasas de resultados falsos positivos y, por lo general, requiere 24 horas de infección20.
Un nuevo sistema de pseudovirus del SARS-CoV-2, el pseudovirus híbrido alfavirus-SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2), ha sido desarrollado recientemente por Hetrick et al12. El Ha-CoV-2 proporciona una nueva herramienta para la cuantificación rápida de la infectividad del virus y la sensibilidad del virus a los anticuerpos neutralizantes en los laboratorios comunes de BSL-2. Estructuralmente, el Ha-CoV-2 se asemeja a la partícula de virión del SARS-CoV-2, que consta de proteínas estructurales del SARS-CoV-2, incluida la proteína S (S), la membrana (M), la nucleocápside (N) y la envoltura (E), y no hay proteína estructural de otros virus. Además, la partícula Ha-CoV-2 contiene un genoma de ARN de expresión rápida de un alfavirus para una rápida expresión reportera en las células. Se ha demostrado que el Ha-CoV-2 mide rápidamente la actividad neutralizante de los anticuerpos en los sueros de individuos vacunados y convalecientes12. Como demostraron Hetrick et al., cuando se comparó con el pseudovirus SARS-CoV-2 basado en lentivirus en un ensayo de curso temporal, el Ha-CoV-2 expresó el reportero de Luc tan pronto como 2-4 h después de la infección, mientras que el pseudovirus de lentivirus expresó Luc después de 24 h12. Además, la aplicación potencial de las variantes de Ha-CoV-2 para cuantificar anticuerpos neutralizantes se demuestra aún más mediante el uso de un anticuerpo neutralizante monoclonal estándar, el 27BV (véase la figura complementaria 1)12. En este trabajo se detalla el uso de la plataforma Ha-CoV-2 para la cuantificación rápida de la infectividad de las variantes del SARS-CoV-2, utilizando como ejemplos las variantes Delta (B.1.617.2) y Ómicron (B.1.1.529). Además, la aplicación potencial de las variantes de Ha-CoV-2 para cuantificar anticuerpos neutralizantes se demuestra aún más mediante el uso de un anticuerpo neutralizante monoclonal estándar, 27BV12.
La plataforma Ha-CoV-2 proporciona un flujo de trabajo rápido, robusto y sencillo para cuantificar variantes virales y neutralizar anticuerpos. Sin embargo, hay algunos pasos críticos que requieren atención. La producción del pseudovirus Ha-CoV-2 debe realizarse utilizando células HEK293T con alta viabilidad. La eficiencia de la cotransfección se puede monitorizar 24 h después de la transfección utilizando el gen reportero GFP del genoma del Ha-CoV-2. El genoma del Ha-CoV-2 puede contener dos reporteros (GFP y Luc), y la GFP puede expresarse durante la cotransfección y después de la infección por Ha-CoV-2 de las células diana12. Las células GFP+ de la infección normalmente se encuentran en un porcentaje bajo (1% a 5%), pero cada célula infectada expresa fuertes señales de GFP (Figura 3). Este bajo porcentaje de GFP puede limitar el uso de GFP como una lectura robusta para cuantificar la neutralización de anticuerpos, en comparación con el reportero de Luc, que cuantifica toda la población de células infectadas.
Al realizar el ensayo de neutralización, es esencial cambiar las puntas de pipeta entre las transferencias de pocillos y asegurarse de que el anticuerpo y el medio libre de suero se mezclen bien para producir resultados precisos. Además, al realizar el protocolo de ensayo de luciferasa, las células deben lisarse completamente durante al menos 3 minutos para garantizar la lisis completa de las células y la liberación de la enzima luciferasa. Esto garantizará la precisión del ensayo. Además, una vez que la solución del ensayo Luciferasa Firefly se agrega a las placas ópticas de 96 pocillos de paredes blancas, la placa debe analizarse dentro de los 10 minutos, ya que la emisión de luz inicial es alta, pero disminuye con el tiempo a medida que se agota el ATP21.
A medida que más variantes del SARS-CoV-2 continúan evolucionando, existe una mayor necesidad de plataformas como Ha-CoV-2 para detectar rápidamente la infectividad de la variante y la sensibilidad de la variante a los anticuerpos neutralizantes inducidos por la vacuna. La plataforma Ha-CoV-2 ofrece una velocidad más rápida, una mayor relación señal-ruido y un protocolo simple en comparación con los ensayos de neutralización basados en pseudovirus existentes 8,9,10,11. La plataforma Ha-CoV-2 también ofrece la ventaja de que se puede utilizar en laboratorios BSL-2 y no requiere el uso de instalaciones BSL-3. Esto permite que la investigación del SARS-CoV-2 se lleve a cabo en laboratorios clínicos y de investigación comunes. Además, la plataforma Ha-CoV-2 produce resultados rápidos en comparación con otros sistemas. Por ejemplo, el estudio de los anticuerpos neutralizantes contra el virus infeccioso SARS-CoV-2 a menudo hace uso de la prueba de neutralización por reducción de placa (PRINT)22. A pesar de que PRINT produce resultados confiables, el conteo manual de las unidades formadoras de placas (UFP) es lento y requiere de 3 a 5 días para obtener resultados23,24. Otros sistemas de pseudotipos, como el lentivirus-pseudovirus, necesitan de 24 a 72 h para producir una señal reportera detectable12. En comparación, el ensayo de neutralización de Ha-CoV-2 puede generar resultados en 18 h. El Ha-CoV-2 proporciona una herramienta conveniente para la detección y cuantificación rápidas de variantes virales y anticuerpos neutralizantes para el monitoreo de pandemias.
El monitoreo de la infectividad del SARS-CoV-2 es esencial a medida que continúan surgiendo más variantes preocupantes (COV). El Ha-CoV-2 ofrece la ventaja de determinar rápidamente la infectividad de los COV. Estudios anteriores han utilizado modelos basados en inteligencia artificial (IA) para analizar cuantitativamente la infectividad de la subvariante Ómicron y las otras variantes del SARS-CoV-2, como la variante Delta25. Estos estudios han demostrado que la variante Ómicron es más contagiosa que el virus original y tiene más probabilidades de escapar a los anticuerpos neutralizantes25. En estos estudios, utilizando Ha-CoV-2, se observaron fenotipos similares. Además, en los ensayos de neutralización de anticuerpos, la variante Ómicron tiene diez veces menos probabilidades de ser neutralizada por 27BV que las cepas de Wuhan y Delta. Estos resultados también son consistentes con la mayor transmisibilidad reportada de la variante Ómicron, que tiene al menos 15 mutaciones en su dominio de unión al receptor (RBD), lo que probablemente aumente la afinidad de unión viral al receptor ACE2 para una mayor transmisibilidad y un mayor escape inmunológico26.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por el fondo interno de investigación de la Universidad George Mason.
27VB1 20 µg SARS-CoV-2 Standard Neutralizing Antibody | Virongy Biosciences | 27VBI-01 | |
500 mL – US Origin FBS | Neuromics | FBS001 | |
AB Mixing Plate: Olympus 96-Well PCR Plate, Non-Skirted UltraThin Wall, Natural, 25 Plates/Unit | Genesee Scientific | Cat# 24-300 | |
Allegra 6R Centrifuge | Beckman Coulter | 2043-30-1158 | |
DMEM (1x) | ThermoFisher | 11995-073 | |
GenClone 25-209, TC Treated Flasks, 250ml, Vent Growth Area: 75.0cm2, 5 per Sleeve, 100 Flasks/Unit | Genesee Scientfic | 25-209 | |
GlowMax Discover Microplate reader | Promega | GM3000 | |
Ha-CoV-2 E Vector | Virongy Biosciences | pCoV2_E | |
Ha-CoV-2 M Vector | Virongy Biosciences | pCoV2_M | |
Ha-CoV-2 N Vector | Virongy Biosciences | pCoV2_N | |
Ha-CoV-2 WT S Vector | Virongy Biosciences | pCoV2_WT S | |
Hek293T cells | ATCC | CRL-3214 | |
Illumination Firefly Luciferase Enhanced Assay Kit 1000 assays | Gold Bio | I-930-1000 | |
Infection Plate: 96-Well Tissue Culture Plate, Greiner Bio-One (With Lid, μClear White Flat Round, Chimney) | VWR | Cat# 82050-758 | |
pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (Ha-CoV-2 Genome) Vector | In house | ||
PEI-based Transfection Reagent | Virongy Biosciences | Transfectin | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Invitrogen | 10378016 | |
Polyethylenimine, branched | Millipore Sigma | 408727-100ML | |
QuantStudio 7 Pro Real-Time PCR System | ThermoFisher | A43163 | |
Ready to use (HEK293T)(ACE2/TMPRSS2) Cells | Virongy Biosciences | Ready-To-Use-Cells | |
SARS-CoV-2 S Omicron (B.1.1.529) Vector | Virongy Biosciences | pCoV2-B.1.1.529 | |
SARS-CoV-2 S Delta (B.1.617.2) Vector | Virongy Biosciences | pCoV2- B.1.617.2 | |
Syringe Filters, PES, 0.22µm | Genesee Scientfic | 25-244 | |
TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | ThermoFisher | 4444432 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher | 15250061 |