تطبيق الفيروس الكاذب Ha-CoV-2 للقياس الكمي السريع لمتغيرات SARS-CoV-2 وتحييد الأجسام المضادة
Summary
يصف هذا البروتوكول تطبيق فيروس كاذب هجين جديد من فيروس ألفا-سارس-كوف-2 (Ha-CoV-2) كمنصة للقياس الكمي السريع لعدوى متغيرات SARS-CoV-2 وحساسيتها لتحييد الأجسام المضادة.
Abstract
سلطت جائحة مرض فيروس كورونا 2019 (COVID-19) الضوء على الحاجة إلى فحوصات سريعة لقياس عدوى متغيرات SARS-CoV-2 الناشئة بدقة وفعالية الأجسام المضادة المعادلة التي يسببها اللقاح ضد المتغيرات الفيروسية. هذه المقايسات ضرورية لترصد الجائحة والتحقق من صحة اللقاحات والمعززات الخاصة بالمتغيرات. توضح هذه المخطوطة تطبيق فيروس كاذب هجين جديد لفيروس ألفا-سارس-كوف-2 (Ha-CoV-2) من أجل القياس الكمي السريع للعدوى المتغيرة ل SARS-CoV-2 والأجسام المضادة المعادلة التي يسببها اللقاح للمتغيرات الفيروسية. Ha-CoV-2 هو جسيم يشبه فيروس SARS-CoV-2 يتكون من بروتينات هيكلية فيروسية (S و M و N و E) وجينوم RNA سريع التعبير مشتق من فيروس ألفا ، فيروس غابة Semliki (SFV). يحتوي Ha-CoV-2 أيضا على كل من البروتين الفلوري الأخضر (GFP) وجينات مراسل luciferase التي تسمح بالقياس الكمي السريع للعدوى الفيروسية. على سبيل المثال ، يتم تحديد عدوى متغيرات SARS-CoV-2 Delta (B.1.617.2) و Omicron (B.1.1.529) ، كما يتم قياس حساسياتها تجاه الجسم المضاد المعادل (27VB). توضح هذه الأمثلة الإمكانات الكبيرة ل Ha-CoV-2 كمنصة قوية للقياس الكمي السريع لمتغيرات SARS-CoV-2 وقابليتها لتحييد الأجسام المضادة.
Introduction
اعتبارا من مايو 2023 ، كان هناك الآن أكثر من 766 مليون حالة COVID-191. على الرغم من حملات التطعيم في جميع أنحاء العالم ، فإن SARS-CoV-2 يدور باستمرار ويصيب الناس ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى ظهور متغيرات جديدة مثل Delta (B.1.617.2) و Omicron (B.1.1.529) التي تدفع موجات جديدة من العدوى 2,3,4. بالنظر إلى أن SARS-CoV-2 يتطور باستمرار ، فمن المهم تطوير فحوصات سريعة يمكنها قياس عدوى المتغيرات الناشئة بدقة وفعالية الأجسام المضادة المعادلة التي يسببها اللقاح ضد هذه المتغيرات. هذه المقايسات ضرورية لترصد الجائحة ولتحديد فعالية اللقاحات ومعززاتها الخاصة بالمتغيرات.
نظرا للطبيعة شديدة العدوى ل SARS-CoV-2 ، يتطلب مركز السيطرة على الأمراض والوقاية منها (CDC) إجراء دراسة SARS-CoV-2 ومتغيراته في مرافق مستوى السلامة البيولوجية (BSL)3 5,6. يحد متطلب BSL-3 هذا من استخدام الفيروسات الحية لتحديد عدوى المتغيرات الفيروسية وأجسامها المضادة المعادلة في الأبحاث الشائعة والمختبرات السريرية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مقايسات تحييد SARS-CoV-2 التقليدية ، مثل المقايسات القائمة على تأثير البلاك أو الاعتلال الخلوي باستخدام الفيروسات الحية ذات الكفاءة المتماثلة ، تستغرق وقتا طويلا وتتطلب فترات حضانة طويلة7. تم تطوير العديد من الفيروسات الكاذبة من النوع الكاذب لبروتين SARS-CoV-2 لتحديد فعالية تحييد الأجسام المضادة8،9،10،11،12. في SARS-CoV-2 ، بروتين S هو البروتين الرئيسي الذي يتوسط دخول الفيروس13 ، وهو المستضد الرئيسي المستخدم في لقاحات SARS-CoV-29،10،14،15،16. تم استخدام الفيروسات ذات النمط الكاذب للبروتين S ، مثل فيروسات التهاب الفم الحويصلي (VSV-G) أو lentivirus ، لتحديد كمية الأجسام المضادة المعادلة17،18،19. ومع ذلك ، فإن الفيروس الكاذب القائم على lentivirus يتطلب عادة 2 إلى 3 أيام من العدوى من أجل تحديد إشارات المراسل. غالبا ما تحتوي أنظمة الفيروسات الكاذبة القائمة على VSV على فيروسات VSV المتبقية ، والتي يمكن أن تؤدي إلى معدلات عالية من النتائج الإيجابية الكاذبة وتتطلب عادة 24 ساعة من العدوى20.
تم مؤخرا تطوير نظام فيروس كاذب جديد ل SARS-CoV-2 ، وهو الفيروس الكاذب الهجين alphavirus-SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2) ، بواسطة Hetrick etal 12. يوفر Ha-CoV-2 أداة جديدة للقياس الكمي السريع لعدوى الفيروس وحساسية الفيروس لتحييد الأجسام المضادة في مختبرات BSL-2 الشائعة. من الناحية الهيكلية ، يشبه Ha-CoV-2 جسيم virion SARS-CoV-2 ، الذي يتكون من بروتينات هيكلية ل SARS-CoV-2 بما في ذلك بروتين S (S) ، والغشاء (M) ، و nucleocapsid (N) ، والغلاف (E) ، ولا يوجد بروتين هيكلي من فيروسات أخرى. بالإضافة إلى ذلك ، يحتوي جسيم Ha-CoV-2 على جينوم RNA سريع التعبير من فيروس ألفا للتعبير السريع في الخلايا. ثبت أن Ha- CoV-2 يقيس بسرعة النشاط المعادل للأجسام المضادة في أمصال الأفراد الذين تم تطعيمهم والنقاهة12. كما أوضح Hetrick et al. ، عند مقارنته بالفيروس الكاذب SARS-CoV-2 القائم على فيروس lentivirus في فحص الدورة الزمنية ، أعرب Ha-CoV-2 عن مراسل Luc في وقت مبكر من 2-4 ساعات بعد الإصابة بينما عبر الفيروس الكاذب lentivirus عن Luc بعد 24 ساعة12. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توضيح التطبيق المحتمل لمتغيرات Ha-CoV-2 لقياس الأجسام المضادة المعادلة بشكل أكبر باستخدام جسم مضاد معادل وحيد النسيلة قياسي ، 27BV (انظر الشكل التكميلي 1)12. يفصل هذا العمل استخدام منصة Ha-CoV-2 للقياس الكمي السريع لعدوى متغيرات SARS-CoV-2 ، باستخدام متغيرات Delta (B.1.617.2) و Omicron (B.1.1.529) كأمثلة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توضيح التطبيق المحتمل لمتغيرات Ha-CoV-2 لتحديد الأجسام المضادة المعادلة باستخدام جسم مضاد قياسي وحيد النسيلة ، 27BV12.
Protocol
Representative Results
Discussion
توفر منصة Ha-CoV-2 سير عمل سريع وقوي وبسيط لتحديد المتغيرات الفيروسية وتحييد الأجسام المضادة. ومع ذلك ، هناك بعض الخطوات الحاسمة التي تحتاج إلى الاهتمام. يجب إجراء إنتاج الفيروس الكاذب Ha-CoV-2 باستخدام خلايا HEK293T ذات قابلية عالية للحياة. يمكن مراقبة كفاءة النقل المشترك بعد 24 ساعة من النقل باستخدام جين مراسل GFP من جينوم Ha-CoV-2. يمكن أن يحتوي جينوم Ha-CoV-2 على مراسلين (GFP و Luc) ، ويمكن التعبير عن GFP أثناء النقل المشترك وبعد عدوى Ha-CoV-2 للخلايا المستهدفة12. عادة ما تكون خلايا GFP + من العدوى بنسبة منخفضة (1٪ إلى 5٪) ، لكن كل خلية مصابة تعبر عن إشارات GFP قوية (الشكل 3). قد تحد هذه النسبة المئوية المنخفضة من GFP من استخدام GFP كقراءة قوية لقياس تحييد الأجسام المضادة ، مقارنة بمراسل Luc ، الذي يحدد عدد الخلايا المصابة بالكامل.
عند إجراء مقايسة التحييد ، من الضروري تغيير أطراف الماصة بين عمليات نقل البئر ولضمان خلط الجسم المضاد والوسط الخالي من المصل جيدا للحصول على نتائج دقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، عند إجراء بروتوكول فحص لوسيفيراز ، يجب تحليل الخلايا بالكامل لمدة 3 دقائق على الأقل لضمان التحلل الكامل للخلايا وإطلاق إنزيم لوسيفيراز. هذا سيضمن دقة الفحص. بالإضافة إلى ذلك ، بمجرد إضافة محلول فحص Firefly luciferase إلى لوحات الآبار البصرية ذات الجدران البيضاء 96 ، يجب تحليل اللوحة في غضون 10 دقائق لأن انبعاث الضوء الأولي مرتفع ولكنه ينخفض بمرور الوقت مع استنفاد ATP21.
مع استمرار تطور المزيد من متغيرات SARS-CoV-2 ، هناك حاجة متزايدة لمنصات مثل Ha-CoV-2 للكشف بسرعة عن العدوى المتغيرة والحساسية المتغيرة للأجسام المضادة المعادلة التي يسببها اللقاح. توفر منصة Ha-CoV-2 سرعة أعلى ونسبة إشارة إلى ضوضاء أعلى وبروتوكولا بسيطا مقارنة بفحوصات التحييد الحالية القائمة على الفيروسات الكاذبة8،9،10،11. توفر منصة Ha-CoV-2 أيضا ميزة أنه يمكن استخدامها في مختبرات BSL-2 ولا تتطلب استخدام مرافق BSL-3. وهذا يسمح ل SARS-CoV-2 بمتابعة الأبحاث في الأبحاث المشتركة والمختبرات السريرية. علاوة على ذلك ، تنتج منصة Ha-CoV-2 نتائج سريعة مقارنة بالأنظمة الأخرى. على سبيل المثال ، غالبا ما تستخدم دراسة تحييد الأجسام المضادة ضد فيروس SARS-CoV-2 المعدي اختبار تحييد تقليل البلاك (PRINT)22. على الرغم من أن PRINT ينتج نتائج موثوقة ، إلا أن العد اليدوي لوحدات تشكيل البلاك (PFUs) بطيء ويتطلب 3-5 أيام للحصول على النتائج23,24. تحتاج أنظمة النمط الكاذب الأخرى ، مثل الفيروس الكاذب lentivirus إلى 24-72 ساعة لإنتاج إشارة مراسل يمكن اكتشافها12. بالمقارنة ، يمكن أن يؤدي اختبار تحييد Ha-CoV-2 إلى نتائج في غضون 18 ساعة. يوفر Ha-CoV-2 أداة ملائمة للفحص السريع والقياس الكمي للمتغيرات الفيروسية وتحييد الأجسام المضادة لرصد الجائحة.
تعد مراقبة عدوى SARS-CoV-2 أمرا ضروريا مع استمرار ظهور المزيد من المتغيرات المثيرة للقلق (VOCs). يوفر Ha-CoV-2 ميزة تحديد عدوى المركبات العضوية المتطايرة بسرعة. استخدمت الدراسات السابقة النمذجة القائمة على الذكاء الاصطناعي (الذكاء الاصطناعي) لتحليل عدوى المتغير الفرعي Omicron ومتغيرات SARS-CoV-2 الأخرى ، مثل متغير دلتا25. أظهرت هذه الدراسات أن متغير Omicron أكثر عدوى من الفيروس الأصلي ، وأكثر عرضة للهروب من الأجسام المضادة المعادلة25. في هذه الدراسات ، باستخدام Ha-CoV-2 ، لوحظت أنماط ظاهرية مماثلة. بالإضافة إلى ذلك ، في مقايسات تحييد الأجسام المضادة ، تقل احتمالية تحييد متغير Omicron بعشر مرات بواسطة 27BV عن سلالات ووهان ودلتا. تتوافق هذه النتائج أيضا مع قابلية الانتقال العالية المبلغ عنها لمتغير Omicron ، والذي يحتوي على 15 طفرة على الأقل في مجال ربط المستقبلات (RBD) ، مما يعزز على الأرجح تقارب الارتباط الفيروسي بمستقبل ACE2 لزيادة قابلية الانتقال وزيادة الهروب المناعي26.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل صندوق الأبحاث الداخلية بجامعة جورج ميسون.
Materials
| 27VB1 20 µg SARS-CoV-2 Standard Neutralizing Antibody | Virongy Biosciences | 27VBI-01 | |
| 500 mL – US Origin FBS | Neuromics | FBS001 | |
| AB Mixing Plate: Olympus 96-Well PCR Plate, Non-Skirted UltraThin Wall, Natural, 25 Plates/Unit | Genesee Scientific | Cat# 24-300 | |
| Allegra 6R Centrifuge | Beckman Coulter | 2043-30-1158 | |
| DMEM (1x) | ThermoFisher | 11995-073 | |
| GenClone 25-209, TC Treated Flasks, 250ml, Vent Growth Area: 75.0cm2, 5 per Sleeve, 100 Flasks/Unit | Genesee Scientfic | 25-209 | |
| GlowMax Discover Microplate reader | Promega | GM3000 | |
| Ha-CoV-2 E Vector | Virongy Biosciences | pCoV2_E | |
| Ha-CoV-2 M Vector | Virongy Biosciences | pCoV2_M | |
| Ha-CoV-2 N Vector | Virongy Biosciences | pCoV2_N | |
| Ha-CoV-2 WT S Vector | Virongy Biosciences | pCoV2_WT S | |
| Hek293T cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Illumination Firefly Luciferase Enhanced Assay Kit 1000 assays | Gold Bio | I-930-1000 | |
| Infection Plate: 96-Well Tissue Culture Plate, Greiner Bio-One (With Lid, μClear White Flat Round, Chimney) | VWR | Cat# 82050-758 | |
| pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (Ha-CoV-2 Genome) Vector | In house | ||
| PEI-based Transfection Reagent | Virongy Biosciences | Transfectin | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Invitrogen | 10378016 | |
| Polyethylenimine, branched | Millipore Sigma | 408727-100ML | |
| QuantStudio 7 Pro Real-Time PCR System | ThermoFisher | A43163 | |
| Ready to use (HEK293T)(ACE2/TMPRSS2) Cells | Virongy Biosciences | Ready-To-Use-Cells | |
| SARS-CoV-2 S Omicron (B.1.1.529) Vector | Virongy Biosciences | pCoV2-B.1.1.529 | |
| SARS-CoV-2 S Delta (B.1.617.2) Vector | Virongy Biosciences | pCoV2- B.1.617.2 | |
| Syringe Filters, PES, 0.22µm | Genesee Scientfic | 25-244 | |
| TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | ThermoFisher | 4444432 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher | 15250061 |
References
- World Health Organization. . Weekly epidemiological update on COVID-19. 143, 1 (2023).
- Dhama, K., et al. Global emerging Omicron variant of SARS-CoV-2: Impacts, challenges and strategies. Journal of Infection and Public Health. 16 (1), 4-14 (2023).
- Dhama, K., et al. Coronavirus Disease 2019-COVID-19. Clinical Microbiology Reviews. 33 (4), e00028-e00020 (2020).
- El-Shabasy, R. M., et al. Three waves changes, new variant strains, and vaccination effect against COVID-19 pandemic. International Journal of Biological Macromolecules. 204, 161-168 (2022).
- CDC. . Interim laboratory biosafety guidelines for handling and processing specimens associated with coronavirus disease 2019 (COVID-19). , (2021).
- Kaufer, A., Theis, T., Lau, K., Gray, J., Rawlinson, W. Laboratory biosafety measures involving SARS-CoV-2 and the classification as a Risk Group 3 biological agent. Pathology. 52 (7), 790-795 (2020).
- Vanderheiden, A., et al. Development of a Rapid Focus Reduction Neutralization Test Assay for Measuring SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies. Current Protocols in Immunology. 131 (1), e116 (2020).
- Dieterle, M. E., et al. A Replication-Competent Vesicular Stomatitis Virus for Studies of SARS-CoV-2 Spike-Mediated Cell Entry and Its Inhibition. Cell Host & Microbe. 28 (3), 486-496 (2020).
- Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
- Nie, J., et al. Establishment and validation of a pseudovirus neutralization assay for SARS-CoV-2. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 680-686 (2020).
- Yang, R., et al. Development and effectiveness of pseudotyped SARS-CoV-2 system as determined by neutralizing efficiency and entry inhibition test in vitro. Biosafety and Health. 2 (4), 226-231 (2020).
- Hetrick, B., et al. Development of a hybrid alphavirus-SARS-CoV-2 pseudovirion for rapid quantification of neutralization antibodies and antiviral drugs. Cell reports methods. 2 (3), 100181 (2022).
- Jackson, C., Farzan, M., Chen, B., Choe, H. Mechanisms of SARS-CoV-2 entry into cells. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (1), 3-20 (2022).
- Jackson, L. A., et al. An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2 – Preliminary Report. The New England Journal of Medicine. 383 (20), 1920-1931 (2020).
- Polack, F. P., et al. Safety and Efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 Vaccine. The New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).
- Li, F. Structure, function, and evolution of coronavirus spike proteins. Annual Review of Virology. 3 (1), 237-261 (2016).
- Donofrio, G. A Simplified SARS-CoV-2 Pseudovirus Neutralization Assay. Vaccines. 9 (4), 389 (2021).
- Crawford, K. H. D., et al. Protocol and Reagents for Pseudotyping Lentiviral Particles with SARS-CoV-2 Spike Protein for Neutralization Assays. Viruses. 12 (5), 513 (2020).
- Zettl, F., et al. Rapid Quantification of SARS-CoV-2-Neutralizing Antibodies Using Propagation-Defective Vesicular Stomatitis Virus Pseudotypes. Vaccines. 8 (3), 386 (2020).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28 (1), e1963 (2018).
- Lundin, A. Optimization of the firefly luciferase reaction for analytical purposes. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 145, 31-62 (2014).
- Deshpande, G. R., et al. Neutralizing antibody responses to SARS-CoV-2 in COVID-19 patients. The Indian Journal of Medical Research. 152 (1 & 2), 82-87 (2020).
- Chen, C., et al. Research progress in methods for detecting neutralizing antibodies against SARS-CoV-2. Analytical Biochemistry. 673, 115199 (2023).
- Manischewitz, J., et al. Development of a novel vaccinia-neutralization assay based on reporter-gene expression. The Journal of Infectious Diseases. 188 (3), 440-448 (2003).
- Chen, J., Wang, R., Gilby, N., Wei, G. Omicron Variant (B.1.1.529): Infectivity, Vaccine Breakthrough, and Antibody Resistance. Journal of Chemical Information and Modeling. 62 (2), 412-422 (2022).
- Saxena, S. K., et al. Characterization of the novel SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) variant of concern and its global perspective. Journal of Medical Virology. 94 (4), 1738-1744 (2022).
