このプロトコルでは、SARS-CoV-2変異体の感染力と中和抗体に対する感受性を迅速に定量化するためのプラットフォームとして、新しいハイブリッドアルファウイルス-SARS-CoV-2偽ウイルス(Ha-CoV-2)のアプリケーションについて説明します。
2019年のコロナウイルス病パンデミック(COVID-19)は、SARS-CoV-2の新たな変異株の感染力と、ウイルス変異株に対するワクチン誘導中和抗体の有効性を正確に測定するための迅速なアッセイの必要性を浮き彫りにしました。これらのアッセイは、パンデミックのサーベイランスや、ワクチンや変異株特異的なブースターの検証に不可欠です。この論文では、SARS-CoV-2変異株の感染力とウイルス変異株に対するワクチン誘導性中和抗体の迅速な定量化のための新規ハイブリッドアルファウイルス-SARS-CoV-2偽ウイルス(Ha-CoV-2)の応用を実証しています。 Ha-CoV-2は、SARS-CoV-2ウイルス様粒子で、ウイルス構造タンパク質(S、M、N、E)とアルファウイルスであるセムリキフォレストウイルス(SFV)由来の高速発現RNAゲノムで構成されています。Ha-CoV-2には、緑色蛍光タンパク質(GFP)とルシフェラーゼレポーター遺伝子の両方が含まれており、ウイルスの感染力を迅速に定量化することができます。一例として、SARS-CoV-2デルタ株(B.1.617.2)とオミクロン株(B.1.1.529)の感染力を定量化し、中和抗体(27VB)に対する感受性も測定します。これらの例は、SARS-CoV-2変異株とその中和抗体に対する感受性を迅速に定量するための堅牢なプラットフォームとしてのHa-CoV-2の大きな可能性を示しています。
2023年5月現在、COVID-19の感染者数は7億6,600万人を超えています1。世界的なワクチン接種キャンペーンにもかかわらず、SARS-CoV-2は、デルタ株(B.1.617.2)やオミクロン株(B.1.1.529)などの新たな変異株の出現により、感染の新たな波を引き起こし、継続的に循環し、人々に感染しています2,3,4。SARS-CoV-2は常に進化しているため、新たな変異株の感染力と、これらの変異株に対するワクチン誘導中和抗体の有効性を正確に測定できる迅速なアッセイを開発することが重要です。これらのアッセイは、パンデミックのサーベイランスや、ワクチンとその変異株特異的なブースターの有効性を判断するために不可欠です。
SARS-CoV-2は感染力が強いため、米国疾病管理予防センター(CDC)は、SARS-CoV-2とその変異株の研究をバイオセーフティレベル(BSL)3施設で実施することを義務付けています5,6。このBSL-3要件は、一般的な研究および臨床検査室におけるウイルス変異体とその中和抗体の感染力を定量化するための生きたウイルスの使用を制限します。さらに、複製能力のある生ウイルスを用いたプラークまたは細胞変性効果に基づくアッセイなど、従来のSARS-CoV-2中和アッセイは時間がかかり、長い潜伏期間を必要とします7。中和抗体の有効性を定量化するために、いくつかのスパイク(S)タンパク質偽型SARS-CoV-2偽ウイルスが開発されています8,9,10,11,12。SARS-CoV-2では、Sタンパク質はウイルスの侵入を媒介する主要なタンパク質であり13、SARS-CoV-2ワクチンで使用される主要な抗原である9,10,14,15,16。水疱性口内炎ウイルス(VSV-G)やレンチウイルスなどのSタンパク質偽型ビリオンは、中和抗体の定量に使用されています17,18,19。それにもかかわらず、レンチウイルスベースの偽ウイルスは、レポーターシグナルを定量化するために通常2〜3日間の感染を必要とします。VSVベースの疑似ウイルスシステムには、VSVウイルスが残留していることが多く、偽陽性率が高くなる可能性があり、通常、24時間の感染が必要です20。
新しいSARS-CoV-2偽ウイルスシステムであるハイブリッドアルファウイルス-SARS-CoV-2偽ウイルス(Ha-CoV-2)が、Hetrickらによって最近開発されました12。Ha-CoV-2は、一般的なBSL-2ラボにおける中和抗体に対するウイルス感染力とウイルス感受性を迅速に定量化するための新しいツールを提供します。構造的には、Ha-CoV-2はSARS-CoV-2ウイルス粒子に似ており、Sタンパク質(S)、膜(M)、ヌクレオカプシド(N)、エンベロープ(E)などのSARS-CoV-2構造タンパク質で構成されており、他のウイルスの構造タンパク質はありません。さらに、Ha-CoV-2粒子には、細胞内でのレポーター発現を高速化するために、アルファウイルス由来の高速発現RNAゲノムが含まれています。Ha-CoV-2は、ワクチン接種者および回復期の個人の血清中の抗体の中和活性を迅速に測定することが示されています12。Hetrickらによって実証されたように、経時的アッセイにおいてレンチウイルスベースのSARS-CoV-2偽ウイルスと比較した場合、Ha-CoV-2は感染後2〜4時間という早い時期にLucレポーターを発現し、レンチウイルス偽ウイルスは24時間後にLucを発現しました12。さらに、標準的なモノクローナル中和抗体27BVを用いることで、中和抗体の定量化にHa-CoV-2変異体が応用できる可能性がさらに実証されています( 補足図1参照)12。この研究では、デルタ株(B.1.617.2)とオミクロン株(B.1.1.529)を例に、SARS-CoV-2変異株の感染力を迅速に定量化するためのHa-CoV-2プラットフォームの使用について詳述しています。さらに、標準的なモノクローナル中和抗体である27BV12を使用することで、中和抗体の定量化にHa-CoV-2変異体が応用できる可能性がさらに実証されています。
Ha-CoV-2プラットフォームは、ウイルス変異体を定量し、抗体を中和するための迅速で堅牢かつシンプルなワークフローを提供します。ただし、注意が必要な重要な手順がいくつかあります。Ha-CoV-2偽ウイルスの産生は、生存率の高いHEK293T細胞を用いて行う必要があります。コトランスフェクション効率は、Ha-CoV-2ゲノム由来のGFPレポーター遺伝子を用いて、トランスフェクションの24時間後にモニターすることができます。Ha-CoV-2ゲノムは2つのレポーター(GFPとLuc)を含むことができ、GFPはコトランスフェクション中および標的細胞のHa-CoV-2感染後に発現することができる12。感染によるGFP+細胞は通常低い割合(1%から5%)ですが、各感染細胞は強いGFPシグナルを発現します(図3)。この低いGFPパーセンテージは、感染細胞の全集団を定量化するLucレポーターと比較して、抗体中和を定量化するための堅牢な読み出しとしてGFPの使用を制限する可能性があります。
中和アッセイを実施する際には、ウェル移送の合間にピペットチップを交換し、正確な結果を得るために抗体と無血清培地を完全に混合することが不可欠です。さらに、ルシフェラーゼアッセイプロトコルを実施する場合、細胞の完全な溶解とルシフェラーゼ酵素の放出を確実にするために、細胞を少なくとも3分間完全に溶解する必要があります。これにより、アッセイの精度が保証されます。さらに、ホタルルシフェラーゼアッセイ溶液を光学白壁の96ウェルプレートに添加すると、最初の発光は高いが、ATPが枯渇するにつれて時間の経過とともに減少するため、プレートは10分以内に分析する必要があります21。
SARS-CoV-2の変異株が進化し続ける中、Ha-CoV-2のようなプラットフォームでは、変異株の感染力やワクチン誘発性中和抗体に対する変異株の感受性を迅速にスクリーニングする必要性が高まっています。Ha-CoV-2プラットフォームは、既存の偽ウイルスベースの中和アッセイと比較して、より高速で、より高いS/N比、およびシンプルなプロトコルを提供します8,9,10,11。また、Ha-CoV-2プラットフォームは、BSL-2ラボで使用でき、BSL-3施設を使用する必要がないという利点もあります。これにより、SARS-CoV-2の研究を一般的な研究や臨床検査室で進めることができます。さらに、Ha-CoV-2プラットフォームは、他のシステムと比較して迅速な結果を生み出します。例えば、感染性SARS-CoV-2ウイルスに対する中和抗体の研究には、プラーク減少中和試験(PRINT)がよく利用されます22。PRINTは信頼性の高い結果を生成しますが、プラーク形成ユニット(PFU)の手動カウントは遅く、結果を得るのに3〜5日かかります23,24。レンチウイルス−偽ウイルスのような他の疑似型システムは、検出可能なレポーターシグナル12を生成するために24〜72時間を必要とする。これに対し、Ha-CoV-2中和アッセイは18時間以内に結果を得ることができます。Ha-CoV-2は、ウイルス変異体の迅速なスクリーニングと定量化、およびパンデミックモニタリングのための中和抗体のための便利なツールを提供します。
SARS-CoV-2の感染力を監視することは、懸念される変異株(VOC)が出現し続ける中、不可欠です。Ha-CoV-2には、VOCの感染力を迅速に測定できるという利点があります。これまでの研究では、人工知能(AI)ベースのモデリングを用いて、オミクロン株の亜種やデルタ株などのSARS-CoV-2の変異株の感染力を定量的に分析していた25。これらの研究により、オミクロン株は元のウイルスよりも感染力が強く、中和抗体を逃れる可能性が高いことが示されています25。Ha-CoV-2を用いたこれらの研究では、同様の表現型が観察されました。さらに、抗体中和アッセイでは、オミクロン株は武漢株やデルタ株よりも27BVによって中和される可能性が10倍低い。これらの結果は、オミクロン株の受容体結合ドメイン(RBD)に少なくとも15の変異があり、ACE2受容体へのウイルス結合親和性を高めて、より高い伝染性と免疫逃避性を高める可能性が高いと報告されていることとも一致しています26。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、ジョージ・メイソン大学の内部研究基金の支援を受けました。
27VB1 20 µg SARS-CoV-2 Standard Neutralizing Antibody | Virongy Biosciences | 27VBI-01 | |
500 mL – US Origin FBS | Neuromics | FBS001 | |
AB Mixing Plate: Olympus 96-Well PCR Plate, Non-Skirted UltraThin Wall, Natural, 25 Plates/Unit | Genesee Scientific | Cat# 24-300 | |
Allegra 6R Centrifuge | Beckman Coulter | 2043-30-1158 | |
DMEM (1x) | ThermoFisher | 11995-073 | |
GenClone 25-209, TC Treated Flasks, 250ml, Vent Growth Area: 75.0cm2, 5 per Sleeve, 100 Flasks/Unit | Genesee Scientfic | 25-209 | |
GlowMax Discover Microplate reader | Promega | GM3000 | |
Ha-CoV-2 E Vector | Virongy Biosciences | pCoV2_E | |
Ha-CoV-2 M Vector | Virongy Biosciences | pCoV2_M | |
Ha-CoV-2 N Vector | Virongy Biosciences | pCoV2_N | |
Ha-CoV-2 WT S Vector | Virongy Biosciences | pCoV2_WT S | |
Hek293T cells | ATCC | CRL-3214 | |
Illumination Firefly Luciferase Enhanced Assay Kit 1000 assays | Gold Bio | I-930-1000 | |
Infection Plate: 96-Well Tissue Culture Plate, Greiner Bio-One (With Lid, μClear White Flat Round, Chimney) | VWR | Cat# 82050-758 | |
pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (Ha-CoV-2 Genome) Vector | In house | ||
PEI-based Transfection Reagent | Virongy Biosciences | Transfectin | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Invitrogen | 10378016 | |
Polyethylenimine, branched | Millipore Sigma | 408727-100ML | |
QuantStudio 7 Pro Real-Time PCR System | ThermoFisher | A43163 | |
Ready to use (HEK293T)(ACE2/TMPRSS2) Cells | Virongy Biosciences | Ready-To-Use-Cells | |
SARS-CoV-2 S Omicron (B.1.1.529) Vector | Virongy Biosciences | pCoV2-B.1.1.529 | |
SARS-CoV-2 S Delta (B.1.617.2) Vector | Virongy Biosciences | pCoV2- B.1.617.2 | |
Syringe Filters, PES, 0.22µm | Genesee Scientfic | 25-244 | |
TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | ThermoFisher | 4444432 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher | 15250061 |