В этом протоколе описывается применение нового гибридного псевдовируса альфавируса SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2) в качестве платформы для быстрой количественной оценки инфекционности вариантов SARS-CoV-2 и их чувствительности к нейтрализующим антителам.
Пандемия коронавирусной инфекции 2019 г. (COVID-19) выявила необходимость экспресс-анализов для точного измерения заразности новых вариантов SARS-CoV-2 и эффективности нейтрализующих антител, индуцированных вакциной, против вариантов вируса. Эти анализы необходимы для эпиднадзора за пандемией и валидации вакцин и бустерных доз, специфичных для конкретных вариантов. В данной статье демонстрируется применение нового гибридного псевдовируса альфавируса SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2) для быстрой количественной оценки инфекционности варианта SARS-CoV-2 и индуцированных вакциной нейтрализующих антител к вариантам вируса. Ha-CoV-2 представляет собой вирусоподобную частицу SARS-CoV-2, состоящую из вирусных структурных белков (S, M, N и E) и генома РНК с быстрой экспрессией, полученного из альфавируса Семликского леса (SFV). Ha-CoV-2 также содержит зеленый флуоресцентный белок (GFP) и репортерные гены люциферазы, которые позволяют быстро количественно оценить инфекционность вируса. В качестве примера можно количественно оценить инфекционность вариантов SARS-CoV-2 Delta (B.1.617.2) и Omicron (B.1.1.529), а также измерить их чувствительность к нейтрализующим антителам (27VB). Эти примеры демонстрируют огромный потенциал Ha-CoV-2 в качестве надежной платформы для быстрого количественного определения вариантов SARS-CoV-2 и их восприимчивости к нейтрализующим антителам.
По состоянию на май 2023 г. в настоящее время зарегистрировано более 766миллионов случаев COVID-191. Несмотря на всемирные кампании вакцинации, SARS-CoV-2 постоянно циркулирует и заражает людей, в основном из-за появления новых вариантов, таких как «Дельта» (B.1.617.2) и «Омикрон» (B.1.1.529), которые вызывают новые волны инфекции 2,3,4. Учитывая, что SARS-CoV-2 постоянно эволюционирует, важно разработать быстрые тесты, которые могут точно измерить заразность новых вариантов и эффективность нейтрализующих антител, индуцированных вакциной, против этих вариантов. Эти анализы необходимы для эпиднадзора за пандемией и для определения эффективности вакцин и их бустерных доз, специфичных для конкретных вариантов.
Из-за высокой контагиозности SARS-CoV-2 Центр по контролю и профилактике заболеваний (CDC) требует, чтобы изучение SARS-CoV-2 и его вариантов проводилосьв учреждениях уровня биобезопасности (BSL) 3 5,6. Это требование BSL-3 ограничивает использование живых вирусов для количественной оценки заразности вариантов вируса и их нейтрализующих антител в обычных исследовательских и клинических лабораториях. Кроме того, традиционные анализы на нейтрализацию SARS-CoV-2, такие как анализы на основе бляшек или цитопатических эффектов с использованием репликационно-компетентных живых вирусов, отнимают много времени и требуют длительных инкубационных периодов7. Для количественной оценки эффективности нейтрализующих антител было разработано несколько псевдовирусов SARS-CoV-2 с псевдотипом спайкового (S) белка 8,9,10,11,12. В SARS-CoV-2 S-белок является основным белком, опосредующим проникновение вируса13, и основным антигеном, используемым в вакцинах против SARS-CoV-2 9,10,14,15,16. Псевдотипированные вирионы S-белка, такие как вирионы вируса везикулярного стоматита (VSV-G) или лентивируса, были использованы для количественного определения нейтрализующих антител 17,18,19. Тем не менее, псевдовирусу, основанному на лентивирусе, обычно требуется от 2 до 3 дней инфекции для количественной оценки репортерных сигналов. Псевдовирусные системы на основе VSV часто содержат остаточные вирусы VSV, что может привести к высокому уровню ложноположительных результатов и, как правило, требует24 ч заражения 20.
Новая псевдовирусная система SARS-CoV-2, гибридный альфавирус-псевдовирус SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2), была недавно разработана Hetrick et al12. Ha-CoV-2 представляет собой новый инструмент для быстрой количественной оценки инфекционности вируса и чувствительности вируса к нейтрализующим антителам в обычных лабораториях BSL-2. Структурно Ha-CoV-2 напоминает вирионную частицу SARS-CoV-2, состоящую из структурных белков SARS-CoV-2, включая S-белок (S), мембрану (M), нуклеокапсид (N) и оболочку (E), и нет структурного белка у других вирусов. Кроме того, частица Ha-CoV-2 содержит быстро экспрессирующийся геном РНК альфавируса для быстрой репортерной экспрессии в клетках. Было показано, что Ha-CoV-2 быстро измеряет нейтрализующую активность антител в сыворотках вакцинированных и выздоравливающих лиц12. Как показали Hetrick et al., при сравнении с псевдовирусом SARS-CoV-2 на основе лентивируса в анализе с течением времени, Ha-CoV-2 экспрессировал репортера Luc уже через 2-4 ч после заражения, в то время как лентивирус-псевдовирус экспрессировал Luc через 24 ч12. Кроме того, потенциальное применение вариантов Ha-CoV-2 для количественного определения нейтрализующих антител дополнительно демонстрируется с использованием стандартного моноклонального нейтрализующего антитела 27BV (см. дополнительный рисунок 1)12. В данной работе подробно описывается использование платформы Ha-CoV-2 для быстрой количественной оценки инфекционности вариантов SARS-CoV-2 на примере вариантов «Дельта» (B.1.617.2) и «Омикрон» (B.1.1.529). Кроме того, потенциальное применение вариантов Ha-CoV-2 для количественного определения нейтрализующих антител дополнительно демонстрируется с использованием стандартного моноклонального нейтрализующего антитела 27BV12.
Платформа Ha-CoV-2 обеспечивает быстрый, надежный и простой рабочий процесс для количественной оценки вариантов вируса и нейтрализации антител. Тем не менее, есть несколько важных шагов, на которые следует обратить внимание. Производство псевдовируса Ha-CoV-2 должно осуществляться с использованием HEK293T клеток с высокой жизнеспособностью. Эффективность котрансфекции можно контролировать через 24 ч после трансфекции с помощью репортерного гена GFP из генома Ha-CoV-2. Геном Ha-CoV-2 может содержать двух репортеров (GFP и Luc), а GFP может экспрессироваться во время котрансфекции и после заражения клетками-мишенями Ha-CoV-212. Инфицированные клетки GFP+ обычно имеют низкий процент (от 1% до 5%), но каждая инфицированная клетка экспрессирует сильные сигналы GFP (рис. 3). Этот низкий процент GFP может ограничивать использование GFP в качестве надежного индикатора для количественной оценки нейтрализации антител по сравнению с репортером Luc, который количественно оценивает всю популяцию инфицированных клеток.
При выполнении анализа на нейтрализацию важно менять наконечники пипеток между переносами лунок и следить за тем, чтобы антитела и среда, не содержащая сыворотки, тщательно смешивались для получения точных результатов. Кроме того, при проведении протокола анализа люциферазы клетки должны быть полностью лизированы в течение не менее 3 мин, чтобы обеспечить полный лизис клеток и высвобождение фермента люциферазы. Это обеспечит точность анализа. Кроме того, после того, как раствор люциферазы Firefly добавляется к оптическим белым стенкам на 96-луночные планшеты, планшет должен быть проанализирован в течение 10 минут, так как начальное световое излучение высокое, но уменьшается со временем по мере истощения АТФ21.
По мере того, как все больше вариантов SARS-CoV-2 продолжают эволюционировать, возрастает потребность в таких платформах, как Ha-CoV-2, для быстрого скрининга на инфекционность вариантов и чувствительность вариантов к нейтрализующим антителам, индуцированным вакциной. Платформа Ha-CoV-2 обеспечивает более высокую скорость, более высокое соотношение сигнал/шум и простой протокол по сравнению с существующими анализами нейтрализации на основе псевдовирусов 8,9,10,11. Преимущество платформы Ha-CoV-2 также заключается в том, что она может использоваться в лабораториях BSL-2 и не требует использования установок BSL-3. Это позволяет проводить исследования SARS-CoV-2 в обычных исследовательских и клинических лабораториях. Кроме того, платформа Ha-CoV-2 дает более быстрые результаты по сравнению с другими системами. Например, при исследовании нейтрализующих антител против инфекционного вируса SARS-CoV-2 часто используется тест нейтрализации бляшек (PRINT)22. Несмотря на то, что PRINT дает надежные результаты, ручной подсчет зубеобразующих единиц (ГОУ) выполняется медленно и требует 3-5 дней для получения результатов23,24. Другим системам псевдотипов, таким как лентивирус-псевдовирус, требуется 24-72 ч для получения обнаруживаемого репортерного сигнала12. Для сравнения, анализ нейтрализации Ha-CoV-2 может дать результаты в течение 18 часов. Ha-CoV-2 представляет собой удобный инструмент для быстрого скрининга и количественной оценки вариантов вируса и нейтрализующих антител для мониторинга пандемии.
Мониторинг заразности SARS-CoV-2 имеет важное значение в связи с появлением новых вариантов, вызывающих озабоченность (ЛОС). Преимущество Ha-CoV-2 заключается в быстром определении инфекционности летучих органических соединений. В предыдущих исследованиях использовалось моделирование на основе искусственного интеллекта (ИИ) для количественного анализа заразности подварианта «Омикрон» и других вариантов SARS-CoV-2, таких как вариант «Дельта»25. Эти исследования показали, что вариант «Омикрон» более заразен, чем исходный вирус, и с большей вероятностью избегает нейтрализующих антител25. В этих исследованиях с использованием Ha-CoV-2 наблюдались сходные фенотипы. Кроме того, в анализах нейтрализации антител вероятность того, что вариант «Омикрон» будет нейтрализован штаммом 27BV, в десять раз ниже, чем штаммы «Ухань» и «Дельта». Эти результаты также согласуются с сообщениями о более высокой трансмиссивности варианта «Омикрон», который имеет не менее 15 мутаций в своем рецептор-связывающем домене (RBD), что, вероятно, повышает сродство связывания вируса с рецептором ACE2 для более высокой трансмиссивности и большего иммунного уклонения26.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана внутренним исследовательским фондом Университета Джорджа Мейсона.
27VB1 20 µg SARS-CoV-2 Standard Neutralizing Antibody | Virongy Biosciences | 27VBI-01 | |
500 mL – US Origin FBS | Neuromics | FBS001 | |
AB Mixing Plate: Olympus 96-Well PCR Plate, Non-Skirted UltraThin Wall, Natural, 25 Plates/Unit | Genesee Scientific | Cat# 24-300 | |
Allegra 6R Centrifuge | Beckman Coulter | 2043-30-1158 | |
DMEM (1x) | ThermoFisher | 11995-073 | |
GenClone 25-209, TC Treated Flasks, 250ml, Vent Growth Area: 75.0cm2, 5 per Sleeve, 100 Flasks/Unit | Genesee Scientfic | 25-209 | |
GlowMax Discover Microplate reader | Promega | GM3000 | |
Ha-CoV-2 E Vector | Virongy Biosciences | pCoV2_E | |
Ha-CoV-2 M Vector | Virongy Biosciences | pCoV2_M | |
Ha-CoV-2 N Vector | Virongy Biosciences | pCoV2_N | |
Ha-CoV-2 WT S Vector | Virongy Biosciences | pCoV2_WT S | |
Hek293T cells | ATCC | CRL-3214 | |
Illumination Firefly Luciferase Enhanced Assay Kit 1000 assays | Gold Bio | I-930-1000 | |
Infection Plate: 96-Well Tissue Culture Plate, Greiner Bio-One (With Lid, μClear White Flat Round, Chimney) | VWR | Cat# 82050-758 | |
pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (Ha-CoV-2 Genome) Vector | In house | ||
PEI-based Transfection Reagent | Virongy Biosciences | Transfectin | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Invitrogen | 10378016 | |
Polyethylenimine, branched | Millipore Sigma | 408727-100ML | |
QuantStudio 7 Pro Real-Time PCR System | ThermoFisher | A43163 | |
Ready to use (HEK293T)(ACE2/TMPRSS2) Cells | Virongy Biosciences | Ready-To-Use-Cells | |
SARS-CoV-2 S Omicron (B.1.1.529) Vector | Virongy Biosciences | pCoV2-B.1.1.529 | |
SARS-CoV-2 S Delta (B.1.617.2) Vector | Virongy Biosciences | pCoV2- B.1.617.2 | |
Syringe Filters, PES, 0.22µm | Genesee Scientfic | 25-244 | |
TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix | ThermoFisher | 4444432 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher | 15250061 |