Toepassing van Ha-CoV-2-pseudovirus voor snelle kwantificering van SARS-CoV-2-varianten en neutraliserende antilichamen

1. Assemblage van virussen en virale deeltjes Vectoren: Koop expressievectoren voor SARS-CoV-2 M, E of N, evenals de SARS-CoV-2 S (Wild-type, Wt), Delta (B.1.617.2) en Omicron (B.1.1.529) commercieel.OPMERKING: Eiwitsequenties van de expressievectoren zijn opgenomen in aanvullend bestand 1. De leverancier van deze expressievectoren is ook te vinden onder de Tabel met materialen. Cellen en celkweek: Onderhoud HEK293T cellen in Dulbecco’s gemodificeerde Eagle’s medium (DMEM) met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 50 eenheden/ml penicilline en 50 μg/ml streptomycine.OPMERKING: Al het celkweekwerk moet worden gedaan in een laminaire luchtstroombioveiligheidskast. De polyethyleenimine (PEI)-transfectie vereist doorgaans 5-6 uur incubatie. Starttijden moeten vooraf zorgvuldig worden overwogen. Virusassemblage en op PEI gebaseerde cotransfectie: Assembleer Ha-CoV-2-deeltjes door cotransfectie van HEK293T cellen. Zaadcellen in een 10 cm celkweek petrischaaltje (4-5 x 10,6 cellen per schaaltje) in 10 ml compleet DMEM-medium de dag voorafgaand aan de cotransfectie. Voor deze studie worden drie petrischaaltjes gebruikt om cellen te zaaien voor de assemblage van respectievelijk Ha-CoV-2 wildtype, Delta en Omicron. Incubeer petrischaaltjes een nacht in een CO2 -incubator bij 37 °C. Controleer de vaat de volgende ochtend om er zeker van te zijn dat de cellen voor 80% samenvloeien. Verwijder het volledige medium en vervang het door 9 ml DMEM serumvrije media. Bereid voor elk gerecht een cotransfectiemengsel met 2,5 μg van elk van de SARS-CoV-2 structurele eiwitexpressievectoren (N, E, M), 10 μg pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (HaCoV2-genoom) en 2,5 μg van de S-eiwitexpressievector, de Delta- of de Omicron S-varianten en 45 μL op PEI gebaseerd transfectiereagens. Laat het cotransfectiemengsel complexen vormen door 13 minuten te incuberen (niet langer dan 30 minuten incuberen). Voeg na de incubatie het cotransfectiemengsel langzaam druppelsgewijs toe aan elke petrischaal. Plaats de schalen gedurende 6 uur in een CO2 -incubator bij 37 °C. Verwijder na 6 uur serumvrije DMEM en vervang deze door volledig DMEM-medium. Oogst het virus 48-60 uur na cotransfectie. Oogsten en opslaan van virussen: Oogst deeltjes 48 uur na cotransfectie. Maak de cellen los door herhaaldelijk over het oppervlak van de monolaag te pipetteren en verzamel de cellen van elke schaal, doe ze in centrifugebuisjes van 15 ml en centrifugeer ze gedurende 5 minuten op 400 x g . Vang het supernatans op en haal het door een filter van 0,22 μM. Bewaar het Ha-CoV-2 pseudovirus bij -80 °C. 2. Virale infectiviteitstest Cellen en celkweek: Onderhoud HEK293T (ACE2/TMPRSS2) cellen in Dulbecco’s gemodificeerde Eagle’s medium (DMEM) met 10% warmte-geïnactiveerde FBS, 50 eenheden/ml penicilline en 50 μg/ml streptomycine. Zaaien van HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-cellen: De dag vóór de virale infectiviteitstest, zaad HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-cellen in een plaat met 96 putjes in 50 μL complete DMEM-media. Zaai voor elke plaat met 96 putjes 2,5 x 104 cellen in elk putje, en er zijn in totaal 2,5 x 106 cellen nodig voor één plaat. Plaats de plaat met 96 putjes een nacht in een CO2 -incubator bij 37 °C. Infectie van HEK293T(ACE2/TMPRSS2): Gebruik deeltjes van Ha-CoV-2-varianten om HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-cellen te infecteren. Verwijder op de ochtend van de infectie 50 μL DMEM uit de vooraf gezaaide plaat met 96 putjes. Vervang media door 50 μL Ha-CoV-2 Wild-type, Delta of Omicron gedurende 18 uur bij 37 °C.OPMERKING: Het protocol kan hier worden gestopt totdat de infectie 18 uur incubatie heeft bereikt en de plaat klaar is om te worden geanalyseerd via Luciferase Assay. Het succes van de infectie wordt bepaald door de Luciferase-test die het resultaat is van het Luciferase-reportergen, dat tot expressie komt in de geïnfecteerde cellen, dus hoe meer signaal wordt geproduceerd, hoe succesvoller de infectie van de Ha-CoV-2-variant is. Luciferase-test: Voeg na 18 uur incubatie 7,5 μL cellysebuffer rechtstreeks toe aan elk putje en meng door orbitaal schudden gedurende 2 minuten. Lysecellen in lysisbuffer gedurende ten minste 5 minuten bij kamertemperatuur. Bereid de Firefly luciferase assay-oplossing door de D-luciferine-oplossing te mengen met de Firefly luciferase-assay-oplossing in een verhouding van 1:50. Combineer voor een hele plaat met 96 putjes 3 ml van de luciferase-substraatoplossing met 60 μl van de D-luciferine-oplossing met 2940 μl van de Firefly luciferase-bufferoplossing. Voeg 25 μL van de Firefly luciferase-testoplossing toe aan de cellysaten en meng de plaat door orbitaal te schudden gedurende 1 minuut. Analyseer de luciferase-activiteit met behulp van een in de handel verkrijgbare luciferase-microplaatlezer. 3. RNA-extractie van Ha-CoV-2 en kwantitatieve reverse transcriptase PCR (RT-qPCR) Virale RNA-extractie: Extraheer het virale RNA uit Ha-CoV-2 Wild-type en de Ha-CoV-2 Delta- en Omicron-variantdeeltjes met behulp van een commerciële virale RNA-extractiekit, volgens de instructies van de fabrikant. Bewaar het geëxtraheerde virale RNA bij -80 °C of gebruik het onmiddellijk voor RT-qPCR. RT-qPCR: Voer RT-qPCR uit op viraal RNA met behulp van een mastermix in één stap. Voer de reactie uit in een in de handel verkrijgbare PCR-machine. Houd er rekening mee dat het doelwit van amplificatie het genomische RNA van Ha-CoV-2 is. Gebruik Ha-CoV-2-vector-DNA als standaard voor het maken van een standaardcurve en het berekenen van het RNA-kopienummer van elke variant. 4. Neutraliserende antilichaamtest Zaaien van HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-cellen: De dag voor de test HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-cellen in een plaat met 96 putjes in 50 μL volledige DMEM-media. HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-cellen worden commercieel aangekocht. Voor het tellen van cellen worden cellen van 20 μl verkregen uit een T75-kolf met HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-cellen en mengen met 20 μl trypanblauwoplossing. Voeg 20 μL van dit mengsel toe aan de telkamer van de cellen en tel het aantal cellen per ml. Om een plaat met 96 putjes voor infectie te zaaien, gebruikt u 2,5 x 104 cellen per putje, en in totaal zijn 2,5 x 106 cellen nodig. Plaats de plaat met 96 putjes een nacht in een CO2 -incubator bij 37 °C. Neutraliserende antilichaamtest: Bereid in een steriele polypropyleen plaat met 96 putjes het standaard 27BV-neutraliserende antilichaam en Ha-CoV-2-mengsel. Voeg 8 μL 27BV (45 mg/ml) toe aan de plaat en voer seriële verdunningen van het antilichaam uit met 6 μL serumvrije DMEM.OPMERKING: Zorg ervoor dat u pipetpunten verwisselt tussen putoverdrachten en zorg ervoor dat het antilichaam en het serumvrije medium grondig worden gemengd om nauwkeurige resultaten te produceren. Voeg aan het serieel verdunde antilichaam 54 μL Ha-CoV-2-deeltje toe en meng het virus en het antilichaam. Pre-incubeer Ha-CoV-2-deeltjes met serieel verdund 27BV gedurende 1 uur bij 37 °C bij 5% CO2. Breng na de incubatie van 1 uur 50 μL van het antilichaam- en Ha-CoV-2-mengsel aan op de plaat met 96 putjes met de HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-cellen (2,5 x 104 cellen per putje) die de dag ervoor zijn gezaaid. Laat voor de controles ten minste drie putjes over die alleen de HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-cellen bevatten. Voeg 50 μL compleet medium toe aan deze putjes om te dienen als niet-geïnfecteerde putjes voor het achtergrondsignaal van de luciferase-testmetingen.OPMERKING: Het protocol kan hier worden gestopt totdat de infectie 18 uur incubatie bij 37 °C heeft bereikt, en dan is de plaat klaar om te worden geanalyseerd via een luciferase-test. Luciferase-test: Voeg na 18 uur incubatie 7,5 μl lysisbuffer rechtstreeks toe aan elk putje en meng door orbitaal schudden gedurende 2 minuten. Lysecellen in lysisbuffer gedurende ten minste 5 minuten bij kamertemperatuur. Bereid de Firefly luciferase assay-oplossing door de D-luciferine-oplossing te mengen met de Firefly luciferase-assay-oplossing in een verhouding van 1:50. Combineer voor een hele plaat met 96 putjes 3 ml van de luciferase-substraatoplossing met 60 μl van de D-luciferine-oplossing met 2940 μl van de firefly luciferase-bufferoplossing. Voeg 25 μL van de Firefly luciferase-testoplossing toe aan de cellysaten en meng de plaat door orbitaal te schudden gedurende 1 minuut. Analyseer de luciferase-activiteit met behulp van een in de handel verkrijgbare luciferase-microplaatlezer. 5. Kwantificering en statistische analyse Gegevensverzameling: Voer infectie- en luciferasetests in drievoud uit zoals aangegeven (Figuur 1). Kwantificeer de luciferase-expressie met luciferase-testmetingen. Het gemiddelde is de gemiddelde waarde van de drie luciferase-testwaarden. Achtergrondsignaalmetingen van niet-geïnfecteerde putten worden van deze gemiddelde waarde afgetrokken. De standaarddeviatie (SD) wordt bepaald aan de hand van de gemiddelde waarde van de luciferase-testwaarden. Gegevensanalyse: Uitzetten van de neutralisatieactiviteit van antilichamen en het berekenen van de ID50-waarden (50% remmingsdosering) met behulp van commerciële grafische software. De ID50-waarde wordt gedefinieerd als de antilichaamremmende verdunningen waarbij een vermindering van 50% van de infectie van HEK293T(ACE2/TMPRSS2)-cellen (op basis van luciferase-testmetingen) wordt bereikt.