L’encefalomielite autoimmune sperimentale è uno dei modelli murini più utilizzati di sclerosi multipla. Nel protocollo attuale, i topi C57BL/6J di entrambi i sessi sono immunizzati con il peptide glicoproteico oligodendrocitario della mielina, con conseguente paresi ascendente della coda e degli arti. Qui discutiamo il protocollo di induzione e valutazione dell’EAE.
La sclerosi multipla (SM) è una malattia infiammatoria cronica autoimmune che colpisce il sistema nervoso centrale (SNC). È caratterizzata da una diversa prevalenza nei sessi, che colpisce più donne che uomini, e da esiti diversi, mostrando forme più aggressive negli uomini che nelle donne. Inoltre, la SM è altamente eterogenea in termini di aspetti clinici, caratteristiche radiologiche e patologiche. Pertanto, è necessario sfruttare modelli animali sperimentali che consentano di indagare il maggior numero possibile di aspetti della patologia. L’encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) rappresenta uno dei modelli più utilizzati di SM nei topi, modellando diverse caratteristiche della malattia, dall’attivazione del sistema immunitario al danno al SNC. Qui descriviamo un protocollo per l’induzione di EAE in topi C57BL/6J sia maschi che femmine utilizzando l’immunizzazione con il peptide glicoproteico 35-55 (MOG35-55) degli oligodendrociti mielinici, che porta allo sviluppo di una forma cronica della malattia. Riportiamo anche la valutazione del punteggio clinico giornaliero e delle prestazioni motorie di questi topi per 28 giorni dopo l’immunizzazione (28 dpi). Infine, illustriamo alcune analisi istologiche di base a livello del SNC, concentrandoci sul midollo spinale come sede primaria del danno indotto dalla malattia.
La sclerosi multipla (SM) è una malattia infiammatoria cronica autoimmune che colpisce il sistema nervoso centrale (SNC). Mostra la presenza di infiltrazione perivascolare di cellule infiammatorie, demielinizzazione, perdita assonale e gliosi1. La sua eziologia rimane sconosciuta e i suoi aspetti clinici, radiografici e patologici suggeriscono una notevole eterogeneità nella malattia2.
A causa della sua eziologia e complessità sconosciute, al momento, nessun modello animale ricapitola tutte le caratteristiche cliniche e radiologiche mostrate nella SMumana 3,4. Tuttavia, vari modelli animali sono impiegati per studiare diversi aspetti della MS 3,4. In questi modelli, l’inizio della malattia è in genere estremamente artificiale e il periodo di insorgenza dei segni clinici è diverso tra gli esseri umani e i topi. Ad esempio, nell’uomo, i processi fisiopatologici alla base della malattia non vengono rilevati per anni prima dell’insorgenza delle manifestazioni cliniche. Al contrario, gli sperimentatori possono rilevare i sintomi nei modelli animali entro settimane o addirittura giorni dopo l’induzione della SM4.
Tre modelli animali di base producono le caratteristiche della demielinizzazione che sono caratteristiche della SM: quelli indotti da virus (ad esempio, il virus dell’encefalomielite murina di Theiler), quelli indotti da agenti tossici (ad esempio, cuprizone, lisolecitina) e le diverse varianti dell’encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE)5. Ogni modello aiuta a studiare alcuni aspetti specifici della malattia, ma nessuno replica tutte le caratteristiche della SM6. Pertanto, è fondamentale scegliere il modello corretto considerando le specifiche esigenze sperimentali e le questioni scientifiche da affrontare.
Grazie alle procedure di immunizzazione contro gli antigeni derivati dalla mielina, l’EAE è indotta dall’innesco di una risposta autoimmune ai componenti del SNC nei topi predisposti. L’interazione tra un’ampia gamma di meccanismi immunopatologici e neuropatologici provoca lo sviluppo dei principali tratti patologici della SM (cioè infiammazione, demielinizzazione, perdita assonale e gliosi) nei topi immunizzati 7,8. I topi iniziano a mostrare sintomi clinici intorno alla seconda settimana dopo l’immunizzazione e generalmente mostrano una paralisi ascendente dalla coda all’arto e all’arto anteriore. Il punteggio clinico (cioè la quantificazione dell’accumulo di deficit correlati alla malattia) è generalmente valutato utilizzando una scala a 5 punti7.
L’immunizzazione attiva con proteine o peptidi o il trasferimento passivo di cellule T encefalitogene possono essere utilizzate per indurre EAE in topi con diversi background genetici (ad esempio, SJL/J, C57BL/6 e topi non obesi-diabetici (NOD)). La proteina proteolipidica della mielina (PLP), la proteina basica della mielina (MBP) e la glicoproteina oligodendrocitaria della mielina (MOG) sono esempi di proteine del sistema nervoso centrale da cui vengono solitamente prodotti gli immunogeni. In particolare, i topi SJL/J immunizzati con l’epitopo immunodominante di PLP (PLP139−151) sviluppano un decorso di malattia recidivante-remittente (RR), mentre i topi C57BL/6J immunizzati con il peptide immunodominante MOG35-55 mostrano EAE di natura cronica1. Nonostante alcune limitazioni, come la scarsità di informazioni sulla progressione della SM, il ruolo delle cellule B nella malattia, i meccanismi inside-out o le difficoltà nello studio della rimielinizzazione, i modelli EAE hanno contribuito enormemente alla comprensione dei processi autoimmuni e neuroinfiammatori, aumentando le conoscenze nel campo della SM e consentendo così lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici per questa malattia4, 6. Introduzione
Nel presente lavoro, ci siamo concentrati su una particolare forma di EAE attivo, la formaindotta dal peptide glicoproteico oligodendrocitario della mielina 35-55 (MOG35-55) 9,10,11,12. L’EAE indotta da MOG35-55 modella una forma cronica di SM. Dopo l’immunizzazione, i topi vanno incontro a una fase asintomatica entro la prima settimana dopo l’immunizzazione, quindi la malattia insorge tipicamente durante la seconda settimana dopo l’immunizzazione, mentre tra la terza e la quarta settimana dopo l’immunizzazione, la malattia diventa cronica, senza possibilità di pieno recupero dai deficit accumulati 7,8,13. È interessante notare che nella maggior parte degli studi presentiin letteratura non si osservano differenze tra maschi e femmine in termini di incidenza, insorgenza della malattia, decorso o progressione, anche se un numero inferiore di studi confronta la malattia nei maschi e nelle femmine.
Al contrario, negli esseri umani, questi parametri sono noti per essere fortemente dimorfici sessualmente2. La sclerosi multipla colpisce più le donne che gli uomini; Tuttavia, gli uomini generalmente sviluppano una forma più aggressiva della malattia2. Queste evidenze hanno suggerito un ruolo essenziale, oltre che complesso, degli ormoni gonadici15; Tuttavia, il ruolo e il meccanismo d’azione degli ormoni sessuali nella patologia rimangono poco chiari. Inoltre, i dati provenienti da modelli animali supportano l’idea che sia gli estrogeni che gli androgeni esercitino effetti positivi su diversi tratti della patologia in modo sesso-specifico 16,17.
Alcuni studi suggeriscono anche effetti neuroprotettivi, promielinizzanti e antinfiammatori del progesterone18 e, sebbene le prove nei pazienti con SM siano scarse18, gli steroidi neuroattivi (cioè steroidi sintetizzati de novo dal sistema nervoso, come il pregnenolone, il tetraidroprogesterone e il diidroprogesterone) potrebbero anche influenzare il decorso patologico19. Collettivamente, questi dati supportano l’idea che gli ormoni sessuali prodotti sia perifericamente che all’interno del sistema nervoso centrale abbiano un ruolo importante e specifico per sesso nell’insorgenza e nella progressione della malattia. Pertanto, nel presente lavoro, sollecitiamo la raccolta di dati separati da animali maschi e femmine.
Dal punto di vista istopatologico, la sostanza bianca del midollo spinale funge da sito principale di lesione del SNC in questo modello, che è caratterizzato da regioni multifocali e confluenti di infiltrazione infiammatoria mononucleare e demielinizzazione8. Pertanto, nel descrivere questo protocollo per l’induzione di EAE indotta da MOG35-55 in topi C57BL/6J, prenderemo in considerazione l’esito della malattia nei due sessi e forniremo alcune informazioni istopatologiche riguardanti il midollo spinale.
Il protocollo EAE indotto da MOG35-55 che abbiamo descritto ha portato allo sviluppo di una forma cronica di SM nei topi C57BL/6J 7,8,13. In questi risultati rappresentativi, abbiamo riportato che gli animali di entrambi i sessi che sono stati sottoposti alla procedura di immunizzazione hanno sviluppato una forma cronica della malattia (cioè, non si riprendono completamente dopo l’insorgenza della malattia, accumulan…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca – MIUR project Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 e 2023-2027 al Dipartimento di Neuroscienze Rita Levi Montalcini; Fondazione Cavalieri-Ottolenghi, Orbassano, Italia. BB è stato borsista di INFRA-P, Regione Piemonte (n.378-35) (2022-2023) e PRIN 2020 – 20203AMKTW. Si ringrazia la Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus (FORB) per il sostegno. Le spese di pubblicazione sono state sostenute dalla gentile donazione del Distretto Rotaract 2031, e in particolare del Rotaract Club Torino Nord-Est. Ringraziamo Elaine Miller per la correzione di bozze del nostro manoscritto.
18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe | Terumo | TER-HYP-18G-112-PIN | |
Digital camera connected to the optical microscope | NIKON DS-U1 digital camera | ||
Electronic precision balance | Merck | Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g | |
Eosin Y | Sigma-Aldrich | HT110216 | |
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml | Sacco System | L003465 | |
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion) | VWR | 213-1170, 213-1172 | |
Hematoxylin (Mayer’s) | Sigma-Aldrich | MHS32 | Filter before using it. |
Image analysis Software | Fiji | ||
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C. |
Isoflurane | Wellona Pharma | This drug is used as inhalational anaesthetic. | |
Male and female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory, Envigo | Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g. | |
Microtome | Leica HistoCore BIOCUT R | ||
Mounting Medium | Merck | 107961 | |
Mouse Rotarod | Ugo Basile | #47600 | |
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra | Difco Laboratories Inc. | 231141 | Store at +4 °C. |
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) | Espikem | EPK1 | Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations. |
Optical microscope | NIKON eclipse 90i | ||
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer. |
Pertussis toxin (PT) | Duotech | PT.181 | Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution |
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution) | B. Eurospital | A 032182038 | Store at +4 °C once opened. |
Saline phosphate buffer (PBS) | Thermo Scientific | J61196.AP | |
Software for image acquisition | NIS-Element AR 2.10 | ||
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle | Nipro | SYMS-0.5U100-3008B-EC | |
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle | PIC | 20,71,26,03,00,354 | |
Vet ointment for eyes | Lacrilube, Lacrigel Europhta | ||
Xylazine | Rompun | This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative. | |
Zolazepam and Tiletamine | Zoletil 100 | This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic |