JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

İki Cinsiyette Multipl Sklerozun Modellenmesi: MOG35-55 ile İndüklenen Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit

Published: October 13, 2023
doi:
10.3791/65778
, , ,
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi (NICO), 2Department of Neuroscience “Rita Levi-Montalcini”,University of Turin, 3School of Pharmacy, Pharmacology Unit,University of Camerino, 4Koelliker Hospital

Summary

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit, multipl sklerozun en yaygın kullanılan murin modellerinden biridir. Mevcut protokolde, her iki cinsiyetten C57BL / 6J fareleri, miyelin oligodendrosit glikoprotein peptidi ile aşılanır ve bu da esas olarak kuyruk ve uzuvların artan parezi ile sonuçlanır. Burada EAE indüksiyonu ve değerlendirme protokolünü tartışıyoruz.

Abstract

Multipl Skleroz (MS), merkezi sinir sistemini (MSS) etkileyen kronik otoimmün inflamatuar bir hastalıktır. Cinsiyetlerde farklı prevalans, erkeklerden daha fazla kadını etkileme ve erkeklerde kadınlardan daha agresif formlar gösteren farklı sonuçlar ile karakterizedir. Ayrıca MS, klinik yönleri, radyolojik ve patolojik özellikleri açısından oldukça heterojendir. Bu nedenle, patolojinin mümkün olduğunca çok yönünün araştırılmasına izin veren deneysel hayvan modellerinden yararlanmak gerekir. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), farelerde en çok kullanılan MS modellerinden birini temsil eder ve bağışıklık sisteminin aktivasyonundan CNS hasarına kadar farklı hastalık özelliklerini modeller. Burada, miyelin oligodendrosit glikoprotein peptid 35-55 (MOG35-55) bağışıklaması kullanılarak hem erkek hem de dişi C57BL / 6J farelerinde EAE’nin indüksiyonu için bir protokol tanımlanmıştır, bu da hastalığın kronik bir formunun gelişmesine yol açar. Ayrıca, bu farelerin bağışıklamadan sonraki 28 gün boyunca günlük klinik skor ve motor performanslarının değerlendirilmesini de rapor ediyoruz (28 dpi). Son olarak, hastalığa bağlı hasarın birincil bölgesi olarak omuriliğe odaklanarak CNS düzeyinde bazı temel histolojik analizleri gösteriyoruz.

Introduction

Multipl Skleroz (MS), merkezi sinir sistemini (MSS) etkileyen kronik otoimmün inflamatuar bir hastalıktır. İnflamatuar hücrelerin perivasküler infiltrasyonu, demiyelinizasyon, aksonal kayıp ve gliozis1 varlığını gösterir. Etiyolojisi tam olarak bilinmemektedir ve klinik yönleri, radyografik ve patolojik özellikleri hastalıkta dikkate değer heterojenliği düşündürmektedir2.

Etiyolojisinin bilinmemesi ve karmaşıklığı nedeniyle, şu anda hiçbir hayvan modeli, insan MS’de görüntülenen tüm klinik ve radyolojik özellikleri özetlememektedir 3,4. Bununla birlikte, MS 3,4’ün farklı yönlerini incelemek için çeşitli hayvan modelleri kullanılmaktadır. Bu modellerde, hastalığın başlaması tipik olarak son derece yapaydır ve klinik belirtilerin başlama süresi insanlar ve fareler arasında farklıdır. Örneğin, insanlarda, hastalığın altında yatan patofizyolojik süreçler, klinik belirtilerin başlamasından yıllar önce tespit edilmez. Tersine, deneyciler MSindüksiyonundan sonraki haftalar hatta günler içinde hayvan modellerinde semptomları tespit edebilirler 4.

Üç temel hayvan modeli, MS’in karakteristiği olan demiyelinizasyon özelliklerini üretir: virüs kaynaklı olanlar (örneğin, Theiler’in murin ensefalomiyelit virüsü), toksik ajanlar tarafından indüklenenler (örneğin, cuprizone, lizolesitin) ve deneysel otoimmün ensefalomiyelitin (EAE) farklı varyantları5. Her model, hastalığın bazı spesifik yönlerini incelemeye yardımcı olur, ancak hiçbiri MS6’nın tüm özelliklerini kopyalamaz. Bu nedenle, belirli deneysel ihtiyaçları ve ele alınacak bilimsel soruları göz önünde bulundurarak doğru modeli seçmek çok önemlidir.

Miyelin türevi antijenlere karşı bağışıklama prosedürleri sayesinde, EAE, duyarlı farelerde CNS bileşenlerine otoimmün bir yanıtı tetikleyerek indüklenir. Çok çeşitli immünopatolojik ve nöropatolojik mekanizmalar arasındaki etkileşim, aşılanmış farelerde MS’in temel patolojik özelliklerinin (yani inflamasyon, demiyelinizasyon, aksonal kayıp ve gliozis) gelişmesine neden olur 7,8. Fareler, aşılamadan sonraki ikinci hafta civarında klinik semptomlar göstermeye başlar ve genellikle kuyruktan uzuv ve ön ayağa artan felç gösterir. Klinik skor (yani, hastalıkla ilişkili eksikliklerin birikiminin ölçülmesi) genellikle 5 puanlık bir ölçek7 kullanılarak değerlendirilir.

Protein veya peptit ile aktif bağışıklama veya ensefalojenik T hücrelerinin pasif transferi, farklı genetik geçmişe sahip farelerde (örneğin, SJL / J, C57BL / 6 ve obez olmayan diyabetik (NOD) fareler) EAE’yi indüklemek için kullanılabilir. Miyelin proteolipid proteini (PLP), miyelin bazik proteini (MBP) ve miyelin oligodendrosit glikoproteini (MOG), immünojenlerin genellikle üretildiği kendi kendine CNS proteinlerinin örnekleridir. Özellikle, PLP’nin immünodominant epitopu (PLP139-151) ile aşılanan SJL/J fareleri, nükseden-düzelen (RR) bir hastalık seyri geliştirirken, immünodominant MOG35-55 peptidi ile aşılanan C57BL/6J fareleri, kronik bir yapıya sahip EAE gösterir1. MS progresyonu hakkında çok az bilgi verilmesi, B hücrelerinin hastalıktaki rolü, içten dışa mekanizmalar veya remiyelinizasyonun incelenmesindeki zorluklar gibi bazı sınırlamalara rağmen, EAE modelleri otoimmün ve nöroinflamatuar süreçlerin anlaşılmasına büyük katkı sağlamış, MS alanındaki bilgiyi arttırmış ve böylece bu hastalık için yeni terapötik yaklaşımların geliştirilmesine olanak sağlamıştır4, 6.

Bu çalışmada, aktif EAE’nin belirli bir formuna, miyelin oligodendrosit glikoprotein peptidi 35-55 (MOG35-55) ile indüklenen form 9,10,11,12’ye odaklandık. MOG35-55 ile indüklenen EAE, kronik bir MS formunu modeller. Bağışıklamadan sonra, fareler bağışıklamadan sonraki ilk hafta içinde asemptomatik bir aşamaya girer, daha sonra hastalık tipik olarak aşılamadan sonraki ikinci hafta içinde ortaya çıkarken, bağışıklamadan sonraki üçüncü ve dördüncü haftalar arasında hastalık kronikleşir ve biriken açıklardan tam iyileşme olasılığı yoktur 7,8,13. İlginç bir şekilde, literatürde bulunan çalışmaların çoğunda insidans, hastalık başlangıcı, seyri veya ilerlemesi açısından erkekler ve kadınlar arasında hiçbir fark gözlenmemiştir14, daha az çalışma erkeklerde ve kadınlarda hastalığı karşılaştırsa bile.

Buna karşılık, insanlarda, bu parametrelerin güçlü bir şekilde cinsel olarak dimorfik olduğu bilinmektedir2. MS erkeklerden daha fazla kadını etkiler; Bununla birlikte, erkekler genellikle hastalığın daha agresif bir formunu geliştirir2. Bu kanıt, gonadal hormonların15 önemli ve karmaşık bir rolünü ortaya koymuştur; Bununla birlikte, seks hormonlarının patolojideki rolü ve etki mekanizması belirsizliğini korumaktadır. Ayrıca, hayvan modellerinden elde edilen veriler, hem östrojenlerin hem de androjenlerin patolojinin farklı yolları üzerinde cinsiyete özgü bir şekilde olumlu etkiler gösterdiği fikrini desteklemektedir16,17.

Bazı çalışmalar ayrıca progesteronun nöroprotektif, promiyelinizan ve antienflamatuar etkilerini göstermektedir18 ve MS hastalarında kanıtlar az olmasına rağmen18, nöroaktif steroidler (yani, pregnenolon, tetrahidroprogesteron ve dihidroprogesteron gibi sinir sistemi tarafından de novo sentezlenmiş steroidler) de patolojik seyrietkileyebilir 19. Toplu olarak, bu veriler hem periferik hem de CNS içinde üretilen seks hormonlarının hastalık başlangıcında ve ilerlemesinde önemli ve cinsiyete özgü bir role sahip olduğu fikrini desteklemektedir. Bu nedenle, bu çalışmada, hem erkek hem de dişi hayvanlardan ayrı verilerin toplanmasını teşvik ediyoruz.

Histopatolojik açıdan bakıldığında, omuriliğin beyaz cevheri, mononükleer inflamatuar infiltrasyon ve demiyelinizasyonunmultifokal, birleşik bölgeleri ile karakterize edilen bu modelde CNS hasarının ana bölgesi olarak hizmet eder 8. Bu nedenle, C57BL/6J farelerinde MOG35-55 ile indüklenen EAE’nin indüksiyonu için bu protokolü tanımlarken, iki cinsiyetteki hastalık sonucunu dikkate alacağız ve omuriliklerle ilgili bazı histopatolojik bilgiler sağlayacağız.

Protocol

Bu çalışmada hayvanların bakımı ve idaresi, 22Eylül 2010 tarihli Avrupa Birliği Konseyi Direktifine (2010/63/UE) göre gerçekleştirilmiştir; Bu çalışmada bildirilen tüm prosedürler İtalya Sağlık Bakanlığı (407/2018-PR) ve Torino Üniversitesi Etik Komitesi (Proje n° 360384) tarafından onaylanmıştır. Deneysel tasarıma, ilk olarak Kilkenny ve ark. 2010’da20. Başlamadan önce gerekli malzemelerin mevcut olduğundan emin olun (bkz. MOG35-55…

Representative Results

Bağışıklama sonrası EAE takibiBu, aşağıda açıklandığı gibi değerlendirildi. Vücut ağırlığı ve gıda alımıİki yönlü varyans analizi (ANOVA) (bağımsız değişkenler olarak cinsiyet ve zaman), özellikle indüksiyondan sonraki ikinci hafta içinde, her iki cinsiyetten EAE hayvanlarının BW’sinde bir azalma olduğunu göstermektedir (F(1,57) = 4.952, p < 0.001; Şekil 2A</strong…

Discussion

Tanımladığımız MOG35-55 kaynaklı EAE protokolü, C57BL / 6J farelerinde kronik bir MS formunun gelişmesine yol açtı 7,8,13. Bu temsili sonuçlarda, bağışıklama prosedürüne tabi tutulan her iki cinsiyetten hayvanların hastalığın kronik bir formunu geliştirdiğini bildirdik (yani, hastalık başlangıcından sonra tam olarak iyileşmezler, açıklar biriktirirler ve kronik fazda en az 1.5’lik bir CS’…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca – MIUR projesi Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 ve 2023-2027 tarafından Sinirbilim Bölümü Rita Levi Montalcini’ye; Cavalieri-Ottolenghi Vakfı, Orbassano, İtalya. BB, INFRA-P, Piedmont Bölgesi (n.378-35) (2022-2023) ve PRIN 2020 – 20203AMKTW üyesiydi. Desteği için Fondazione per la Ricerca Biomedica Onlus’a (FORB) teşekkür ederiz. Yayın ücretleri, Distretto Rotaract 2031’in ve özellikle Rotaract Club Torino Nord-Est’in bağışlarıyla desteklenmiştir. Elaine Miller’a makalemizin redaksiyonu için teşekkür ederiz.

Materials

18 G x 1 ½“ 1.2 x 40 mm needle for the glass syringe  Terumo TER-HYP-18G-112-PIN
Digital camera connected to the optical microscope NIKON DS-U1 digital camera
Electronic precision balance Merck Mod. Kern-440-47N, resolution 0.1 g
Eosin Y Sigma-Aldrich HT110216
Glass syringe pipet “ultra asept” 10 ml Sacco System  L003465
Glassware (i.e., becker to prepare the emulsion) VWR 213-1170, 213-1172
Hematoxylin (Mayer’s) Sigma-Aldrich MHS32 Filter before using it. 
Image analysis Software Fiji
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) Sigma-Aldrich F5506 Store at +4 °C. 
Isoflurane Wellona Pharma This drug is used as inhalational anaesthetic.
Male and female C57BL/6J mice Jackson Laboratory, Envigo Age 8-10 weeks, optimal body weight of ~20 g. 
Microtome Leica HistoCore BIOCUT R
Mounting Medium  Merck 107961
Mouse Rotarod Ugo Basile  #47600
Mycobacterium tuberculosis (MT), strain H37Ra  Difco Laboratories Inc.  231141 Store at +4 °C.
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55) Espikem EPK1 Store at -80 °C diluted (2 mg/mL) in physiological solution; prepare it on the day of the immunization to avoid, as much as possible, alterations or contaminations. 
Optical microscope NIKON eclipse 90i
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127 Store at +4 °C once diluted (4%) in phosphate buffer. 
Pertussis toxin (PT) Duotech  PT.181 Store at -80°C diluted (concentration 5 µg/mL) in physiological solution 
Physiological solution (sodium chloride 0.9% solution) B. Eurospital A 032182038 Store at +4 °C once opened.
Saline phosphate buffer (PBS) Thermo Scientific J61196.AP
Software for image acquisition  NIS-Element AR 2.10
Syringes U-100 0.5 mL with 30 G x 5/16” (0.30 x 8 mm) in fixed needle  Nipro SYMS-0.5U100-3008B-EC
Syringes U-100 1 mL with 26G x ½” (0.45 x 12.7 mm) in needle PIC 20,71,26,03,00,354
Vet ointment for eyes Lacrilube, Lacrigel Europhta
Xylazine Rompun This mixture of drug is used as injectable anaesthetic and sedative. 
Zolazepam and Tiletamine Zoletil  100 This drug is used as injectable anaesthetic, sedative, muscle relaxer, and analgesic
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thompson, A. J., Baranzini, S. E., Geurts, J., Hemmer, B., Ciccarelli, O. Multiple sclerosis. Lancet. 391 (10130), 1622-1636 (2018).
  2. Gold, S. M., Willing, A., Leypoldt, F., Paul, F., Friese, M. A. Sex differences in autoimmune disorders of the central nervous system. Semin immunopathol. 41 (2), 177-188 (2019).
  3. Smith, P. Animal models of multiple sclerosis. Curr Protoc. 1 (6), 185 (2021).
  4. Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
  5. Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia. 35 (1), 32-39 (2020).
  6. Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: a clinical and histopathological perspective. Brain Pathol. 27 (2), 123-137 (2017).
  7. Racke, M. K. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Curr Protoc Neurosci. , (2001).
  8. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O’Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  9. Montarolo, F., Perga, S., Martire, S., Bertolotto, A. Nurr1 reduction influences the onset of chronic EAE in mice. Inflamm Res. 64 (11), 841-844 (2015).
  10. Montarolo, F., et al. Effects of isoxazolo-pyridinone 7e, a potent activator of the Nurr1 signaling pathway, on experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. PLoS One. 9 (9), 108791 (2014).
  11. Furlan, C., et al. Analysis of the gadolinium retention in the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) murine model of multiple sclerosis. J Trace Elem Med Biol. 68, 126831 (2021).
  12. Desole, C., et al. Engineering, characterization, and biological evaluation of an antibody targeting the HGF receptor. Front Immunol. 12, 775151 (2021).
  13. Voskuhl, R. R., MacKenzie-Graham, A. Chronic experimental autoimmune encephalomyelitis is an excellent model to study neuroaxonal degeneration in multiple sclerosis. Front Mol Neurosci. 15, 1024058 (2022).
  14. McCombe, P. A., Greer, J. M. Effects of biological sex and pregnancy in experimental autoimmune encephalomyelitis: It’s complicated. Front Immunol. 13, 1059833 (2022).
  15. Ascherio, A., Munger, K. L. Epidemiology of multiple sclerosis: from risk factors to prevention-an update. Semin Neurol. 36 (2), 103-114 (2016).
  16. Spence, R. D., Voskuhl, R. R. Neuroprotective effects of estrogens and androgens in CNS inflammation and neurodegeneration. Front Neuroendocrinol. 33 (1), 105-115 (2012).
  17. Laffont, S., Garnier, L., Lélu, K., Guéry, J. -. C. Estrogen-mediated protection of experimental autoimmune encephalomyelitis: Lessons from the dissection of estrogen receptor-signaling in vivo. Biomed J. 38 (3), 194-205 (2015).
  18. Avila, M., Bansal, A., Culberson, J., Peiris, A. N. The role of sex hormones in multiple sclerosis. Eur Neurol. 80 (1-2), 93-99 (2018).
  19. Collongues, N., Patte-Mensah, C., De Seze, J., Mensah-Nyagan, A. -. G., Derfuss, T. Testosterone and estrogen in multiple sclerosis: from pathophysiology to therapeutics. Expert Rev Neurother. 18 (6), 515-522 (2018).
  20. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), 1000412 (2010).
  21. Shaw, M. K., Zhao, X., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778 (2012).
  22. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  23. Downton, P., Early, J. O., Gibbs, J. E. Circadian rhythms in adaptive immunity. Immunology. 161 (4), 268-277 (2020).
  24. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
  25. Rahn, E. J., Iannitti, T., Donahue, R. R., Taylor, B. K. Sex differences in a mouse model of multiple sclerosis: neuropathic pain behavior in females but not males and protection from neurological deficits during proestrus. Biol Sex Differ. 5 (1), 4 (2014).
  26. Bonaldo, B., et al. Effects of perinatal exposure to bisphenol A or S in EAE model of multiple sclerosis. Cell Tissue Res. 392 (2), 467-480 (2023).
  27. vanden Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
  28. Bolton, C., Smith, P. Defining and regulating acute inflammatory lesion formation during the pathogenesis of multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. CNS Neurol Disord Drug Targets. 14 (7), 915-935 (2015).
  29. Glaser, J. R., Glaser, E. M. Neuron imaging with Neurolucida–a PC-based system for image combining microscopy. Comput Med Imaging Graph. 14 (5), 307-317 (1990).
  30. Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats. Lab Anim (NY). 40 (2), 53-57 (2011).
  31. Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G., Heise, C., Watson, C., Paxinos, G., Kayalioglu, G. Chapter 16 – Atlas of the mouse spinal cord. The Spinal. , 308-379 (2009).
  32. Khan, A., et al. Suppression of TRPV1/TRPM8/P2Y nociceptors by withametelin via downregulating MAPK signaling in mouse model of vincristine-induced neuropathic pain. Int J Mol Sci. 22 (11), 6084 (2021).
  33. Bergamaschi, R. Prognostic factors in multiple sclerosis. Int Rev Neurobiol. 79, 423-447 (2007).
  34. Harbo, H. F., et al. Genes in the HLA class I region may contribute to the HLA class II-associated genetic susceptibility to multiple sclerosis. Tissue Antigens. 63 (3), 237-247 (2004).
  35. Ryan, L., Mills, K. H. G. Sex differences regulate immune responses in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Eur J Immunol. 52 (1), 24-33 (2022).
  36. Lasrado, N., et al. Mechanisms of sex hormones in autoimmunity: focus on EAE. Biol Sex Differ. 11 (1), 50 (2020).
  37. Hofstetter, H. H., Shive, C. L., Forsthuber, T. G. Pertussis toxin modulates the immune response to neuroantigens injected in incomplete Freund’s adjuvant: induction of Th1 cells and experimental autoimmune encephalomyelitis in the presence of high frequencies of Th2 cells. J Immunol. 169 (1), 117-125 (2002).
  38. Maria, Z., Turner, E., Agasing, A., Kumar, G., Axtell, R. C. Pertussis toxin inhibits encephalitogenic T-cell infiltration and promotes a B-cell-driven disease during Th17-EAE. Int J Mol Sci. 22 (6), 2924 (2021).
  39. Krementsov, D. N., et al. Studies in experimental autoimmune encephalomyelitis do not support developmental bisphenol a exposure as an environmental factor in increasing multiple sclerosis risk. Toxicol Sci. 135 (1), 91-102 (2013).
  40. Kummari, E., Nichols, J. M., Yang, E. -. J., Kaplan, B. L. F. Neuroinflammation and B-cell phenotypes in cervical and lumbosacral regions of the spinal cord in experimental autoimmune encephalomyelitis in the absence of pertussis toxin. Neuroimmunomodulation. 26 (4), 198-207 (2019).
  41. Huntemann, N., et al. An optimized and validated protocol for inducing chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6J mice. J Neurosci Methods. 367, 109443 (2022).

Tags

Multiple SclerosisExperimental Autoimmune EncephalomyelitisEAE ModelSex DifferencesMOG35-55Clinical AssessmentNeuroinflammationAutoimmune DiseaseCentral Nervous System

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bonaldo, B., Casile, A., Montarolo, F., Bertolotto, A. Modeling Multiple Sclerosis in the Two Sexes: MOG35-55-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (200), e65778, doi:10.3791/65778 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image