Psödotipli virüsler (PV’ler), otantik virüsleri işlemekten daha güvenli koşullar altında konak-virüs etkileşimlerini incelemek için kullanılan replikasyon kusurlu virionlardır. Burada, SARS-CoV-2 PV’lerin COVID-19 aşılamasından sonra hastaların serumunun nötralize edici yeteneğini test etmek için nasıl kullanılabileceğini gösteren ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.
Psödotipli virüsler (PV’ler), ilgilenilen bir genin verilmesi için gen terapisinde daha iyi bilinen kullanımlarına ek olarak, konak-virüs etkileşimlerini incelemek ve serum örneklerinin nötralize edici yeteneğini test etmek için kullanılabilen moleküler araçlardır. PV’ler replikasyon kusurludur çünkü viral genom, PV’lere dahil edilmeyen farklı plazmitlere bölünmüştür. Bu güvenli ve çok yönlü sistem, biyogüvenlik seviye 2 laboratuvarlarında PV’lerin kullanılmasına izin verir. Burada, burada belirtildiği gibi üç plazmide dayalı lentiviral PV’ler üretmek için genel bir metodoloji sunuyoruz: (1) enfeksiyonu izlemek için gereken raportör geni taşıyan omurga plazmidi; (2) PV’leri üretmek için gereken tüm yapısal proteinler için genleri taşıyan ambalaj plazmidi; (3) virüs tropizmini belirleyen ve konakçı hücreye viral girişe aracılık eden zarf yüzeyi glikoprotein ekspresyon plazmidi. Bu çalışmada, SARS-CoV-2 Spike, replikatif olmayan SARS-CoV-2 psödotipli lentivirüslerin üretimi için kullanılan zarf glikoproteinidir.
Kısaca, paketleme hücreleri (HEK293T) standart yöntemler kullanılarak üç farklı plazmit ile birlikte transfekte edildi. 48 saat sonra, PV’leri içeren süpernatan hasat edildi, filtrelendi ve -80 °C’de depolandı. SARS-CoV-2 PV’lerin enfektivitesi, enfeksiyondan 48 saat sonra bir hedef hücre hattında raportör genin (lusiferaz) ekspresyonu incelenerek test edildi. Bağıl lüminesans birimleri (RLU’lar) için değer ne kadar yüksek olursa, enfeksiyon/transdüksiyon oranı o kadar yüksek olur. Ayrıca, enfeksiyöz PV’ler, RLU yoğunluğundaki azalma olarak ölçülen, psödovirüslerin hedef hücrelere girişinin nötralizasyon sürecini incelemek için seri olarak seyreltilmiş serum örneklerine eklendi: yüksek nötralize edici aktiviteye karşılık gelen daha düşük değerler.
Psödotipli virüsler (PV’ler), mikrobiyolojide konak-virüs ve patojen-patojen etkileşimlerini incelemek için kullanılan moleküler araçlardır 1,2,3,4. PV’ler, viral genomu koruyan viral çekirdek olan bir iç kısımdan ve bir dış kısımdan, tropizmi tanımlayan virüsün yüzeyindeki zarf glikoproteinlerinden oluşur5. Bir psödovirüs, yeni viral parçacıklar oluşturmak için tüm genetik bilgiyi içermediği için hedef hücrede replikasyon yetersizdir. Tuhaf özelliklerin bu kombinasyonu, PV’leri vahşi tip bir virüse güvenli bir alternatif haline getirir. Vahşi tip virüsler ise oldukça patojeniktir ve BSL 2 laboratuvarlarında analiz içinkullanılamaz 6.
PV’lerin enfektivitesi, genellikle bir floresan proteini (GFP, RFP, YFP) veya kemilüminesan ürünler (lusiferaz) üreten bir enzimi kodlayan bir raportör gen tarafından izlenebilir. Bu, PV üretimi için kullanılan plazmitlerden birinde bulunur ve psödovirüs7’nin genomuna dahil edilir.
Şu anda HIV-1 genomuna dayanan lentiviral türevli parçacıklar da dahil olmak üzere çeşitli PV çekirdek türleri mevcuttur. HIV-1 tabanlı PV’lerin diğer platformlara göre en büyük avantajı, hedef hücre genomundaki içsel entegrasyon süreçleridir8. HIV-1 oldukça bulaşıcı bir virüs olmasına ve AIDS’e neden olmasına rağmen, bu lentiviral vektörlerin yıllar boyunca kapsamlı optimizasyon adımları nedeniyle kullanımı güvenlidir. Viral genlerin transdüksiyon yeteneklerini etkilemeden tükendiği 2nd nesil lentiviral vektörün piyasaya sürülmesiyle optimal güvenlik koşulları sağlandı9. 3. ve 4. nesiller, viral genomun ayrı plazmitlere daha fazla bölünmesiyle lentiviral vektör işlemenin artan güvenliğine katkıda bulundu10,11. En yeni nesil PV’ler genellikle gen terapisi için lentiviral vektörler üretmek için kullanılır.
PV’ler, hem üretim hem de enfeksiyon aşamalarında virüsler ve konakçı hücreler arasındaki etkileşimleri incelemek için kullanılabilir. PV’ler özellikle psödovirüs nötralizasyon deneylerinde (PVNA) kullanılır. PVNA’lar, PV’nin zarfı12,13 üzerindeki viral glikoproteini hedefleyerek serum veya plazmanın nötralizasyon potansiyelini değerlendirmek için geniş çapta doğrulanmıştır. İnhibitör konsantrasyon 50 (IC50) olarak ifade edilen nötralizasyon aktivitesi, viral partikül girişinin %50’sini bloke eden serum/plazmanınseyreltilmesi olarak tanımlanır 14. Bu protokolde, bir rapel aşı dozu almadan önce ve sonra toplanan serumlarda Şiddetli Akut Solunum Sendromu – Koronavirüs 2’ye (SARS-CoV-2) karşı antikor aktivitesini test etmek için bir PVNA’nın kurulumunu tanımladık.
Vahşi tip bir virüs kullanmak gerçek enfeksiyonu simüle etse de, lentiviral PV’ler, patojenik virüslerle çalışmak için gerekli katı güvenlik gereksinimleri olmadan viral giriş ve enfeksiyonla ilişkili mekanizmaları incelemek için daha güvenli bir seçenektir 4,20,21. PV’ler, çalışmanın amacı olan patojenik bir virüsün yüzey zarfı glikoproteini ile çevrili replikasyon kusurlu bir viral çekirdekten oluş…
The authors have nothing to disclose.
Sağlık çalışanları gönüllülerinin katkılarını kabul ediyoruz. Bu proje, Mükemmellik Departmanı 2023/2027, MUR, İtalya tarafından desteklenmiştir. AR ve DZ, PRIN2022 (AB fonları; Yeni NesilEU)
0.45 μm filter | SARSTEDT | 83 1826 | |
6-well plate | SARSTEDT | 83 3920 | |
96-well plate | SARSTEDT | 8,33,924 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck | 10403892 | |
Black Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 60005270 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | SIGMA-ALDRICH | D6546 – 500ML | |
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x) | AUROGENE | AU-L0615-500 | |
Foetal Bovine Serum | AUROGENE | AU-S1810-500 | |
Graphpad Prism version 7 | graphpad dotmatics | NA | In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program' |
HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
HEK293T/ACE2 cells | ATCC | CRL-3216 | HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector. |
L-glutamine | AUROGENE | AU-X0550-100 | |
Luminometer – Victor3 | Perkin Elmer | HH35000500 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'luminometer' |
Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium' |
p8.91 packaging plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
pCSFLW reporter plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
Penicillin/streptomycin | AUROGENE | AU-L0022-100 | |
Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa) | SIGMA-ALDRICH | 408727 | |
RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) | Addgene | 145839 | This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2 |
SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid | Addgene | pGBW-m4137382 | |
steadylite plus Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6066759 | In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent' |
Trypsin EDTA 1x | AUROGENE | AU-L0949-100 |