Pseudotypisierte Viren als molekulares Werkzeug zur Überwachung humoraler Immunantworten gegen SARS-CoV-2 mittels Neutralisationsassay
Summary
Pseudotypisierte Viren (PVs) sind replikationsdefekte Virionen, die verwendet werden, um Wirt-Virus-Interaktionen unter sichereren Bedingungen zu untersuchen als mit authentischen Viren. Hier wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, das zeigt, wie SARS-CoV-2-PVs verwendet werden können, um die neutralisierende Fähigkeit des Serums von Patienten nach einer COVID-19-Impfung zu testen.
Abstract
Pseudotypisierte Viren (PVs) sind molekulare Werkzeuge, die verwendet werden können, um Wirt-Virus-Interaktionen zu untersuchen und die neutralisierende Fähigkeit von Serumproben zu testen, zusätzlich zu ihrer bekannteren Verwendung in der Gentherapie für die Verabreichung eines Gens von Interesse. PVs sind replikationsfehlerhaft, weil das virale Genom in verschiedene Plasmide unterteilt ist, die nicht in die PVs eingebaut sind. Dieses sichere und vielseitige System ermöglicht den Einsatz von PVs in Laboren der Biosicherheitsstufe 2. Hier stellen wir eine allgemeine Methodik zur Herstellung von lentiviralen PVs vor, die auf drei Plasmiden basiert, wie hier erwähnt: (1) das Rückgratplasmid, das das Reportergen trägt, das zur Überwachung der Infektion benötigt wird; (2) das Verpackungsplasmid, das die Gene für alle Strukturproteine enthält, die zur Erzeugung der PVs benötigt werden; (3) Das Expressionsplasmid der Hülloberfläche, das den Virustropismus bestimmt und den Eintritt des Virus in die Wirtszelle vermittelt. In dieser Arbeit ist SARS-CoV-2 Spike das Hüllglykoprotein, das für die Produktion von nicht-replikativen SARS-CoV-2-pseudotypisierten Lentiviren verwendet wird.
Kurz gesagt, Verpackungszellen (HEK293T) wurden mit den drei verschiedenen Plasmiden unter Verwendung von Standardmethoden co-transfiziert. Nach 48 h wurde der Überstand, der die PVs enthielt, geerntet, filtriert und bei -80 °C gelagert. Die Infektiosität von SARS-CoV-2-PVs wurde getestet, indem die Expression des Reportergens (Luciferase) in einer Zielzelllinie 48 h nach der Infektion untersucht wurde. Je höher der Wert für relative Lumineszenzeinheiten (RLUs) ist, desto höher ist die Infektions-/Transduktionsrate. Darüber hinaus wurden die infektiösen PVs zu den seriell verdünnten Serumproben hinzugefügt, um den Neutralisationsprozess des Eintritts von Pseudoviren in die Zielzellen zu untersuchen, gemessen als Verringerung der RLU-Intensität: niedrigere Werte entsprechen einer hohen neutralisierenden Aktivität.
Introduction
Pseudotypisierte Viren (PVs) sind molekulare Werkzeuge, die in der Mikrobiologie verwendet werden, um Wirt-Virus- und Pathogen-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen 1,2,3,4. PVs bestehen aus einem inneren Teil, dem viralen Kern, der das virale Genom schützt, und einem äußeren Teil, den Hüllglykoproteinen auf der Oberfläche des Virus, die den Tropismus definieren5. Ein Pseudovirus ist in der Zielzelle replikationsunfähig, da es nicht die gesamte genetische Information enthält, um neue Viruspartikel zu erzeugen. Diese Kombination von besonderen Eigenschaften macht PVs zu einer sicheren Alternative zu einem Wildtyp-Virus. Wildtypviren hingegen sind hochpathogen und können in BSL 2-Laboren nicht zur Analyse verwendet werden6.
Die Infektiosität von PVs kann durch ein Reportergen überwacht werden, das in der Regel für ein fluoreszierendes Protein (GFP, RFP, YFP) oder ein Enzym kodiert, das chemilumineszierende Produkte (Luciferase) produziert. Dieses ist in einem der Plasmide enthalten, die für die PV-Produktion verwendet werden, und wird in das Genom des Pseudoviruseingebaut 7.
Derzeit gibt es verschiedene Arten von PV-Kernen, darunter lentivirale Partikel, die auf dem Genom von HIV-1 basieren. Der große Vorteil von HIV-1-basierten PVs gegenüber anderen Plattformen ist ihr intrinsischer Integrationsprozess im Genom der Zielzelle8. Obwohl HIV-1 ein hochansteckendes Virus ist und der Erreger von AIDS ist, sind diese lentiviralen Vektoren aufgrund der umfangreichen Optimierungsschritte im Laufe der Jahre sicher in der Anwendung. Optimale Sicherheitsbedingungen wurden mit der Einführung von lentiviralen Vektoren der 2. Generation erreicht, bei denen virale Gene depleutet wurden, ohne die Transduktionsfähigkeit zu beeinflussen9. Die 3. und 4. Generation trugen mit der weiteren Aufspaltung des viralen Genoms in separate Plasmide zur erhöhten Sicherheit des lentiviralen Vektorhandlings bei10,11. Die neuesten Generationen von PVs werden in der Regel zur Herstellung von lentiviralen Vektoren für die Gentherapie eingesetzt.
PVs können verwendet werden, um Interaktionen zwischen Viren und Wirtszellen sowohl während der Produktions- als auch während der Infektionsphase zu untersuchen. PVs werden insbesondere in Pseudovirus-Neutralisationsassays (PVNA) eingesetzt. PVNAs werden umfassend validiert, um das Neutralisationspotenzial von Serum oder Plasma zu bewerten, indem sie auf das virale Glykoprotein auf der Hülle des PV abzielen12,13. Die Neutralisationsaktivität, ausgedrückt als Hemmkonzentration 50 (IC50), ist definiert als die Verdünnung von Serum/Plasma, die 50 % des Eintritts von Viruspartikeln blockiert14. In diesem Protokoll beschrieben wir den Aufbau einer PVNA, um die Antikörperaktivität gegen das Severe Acute Respiratory Syndrome – Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in Seren zu testen, die vor und nach Erhalt einer Auffrischungsimpfung gesammelt wurden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obwohl die Verwendung eines Wildtyp-Virus die tatsächliche Infektion simuliert, sind lentivirale PVs eine sicherere Option, um die Mechanismen zu untersuchen, die mit dem Eindringen und der Infektion von Viren verbunden sind, ohne die strengen Sicherheitsanforderungen, die für die Arbeit mit pathogenen Viren erforderlich sind 4,20,21. PVs bestehen aus einem replikationsdefekten Viruskern, der von der Oberflächenhülle eines p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir würdigen den Beitrag der freiwilligen Helfer im Gesundheitswesen. Dieses Projekt wurde vom Department of Excellence 2023/2027, MUR, Italien, unterstützt. AR und DZ wurden durch PRIN2022 (EU-Fördermittel; NextGenerationEU)
Materials
| 0.45 μm filter | SARSTEDT | 83 1826 | |
| 6-well plate | SARSTEDT | 83 3920 | |
| 96-well plate | SARSTEDT | 8,33,924 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck | 10403892 | |
| Black Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 60005270 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | SIGMA-ALDRICH | D6546 – 500ML | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x) | AUROGENE | AU-L0615-500 | |
| Foetal Bovine Serum | AUROGENE | AU-S1810-500 | |
| Graphpad Prism version 7 | graphpad dotmatics | NA | In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program' |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEK293T/ACE2 cells | ATCC | CRL-3216 | HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector. |
| L-glutamine | AUROGENE | AU-X0550-100 | |
| Luminometer – Victor3 | Perkin Elmer | HH35000500 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'luminometer' |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium' |
| p8.91 packaging plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| pCSFLW reporter plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| Penicillin/streptomycin | AUROGENE | AU-L0022-100 | |
| Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa) | SIGMA-ALDRICH | 408727 | |
| RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) | Addgene | 145839 | This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2 |
| SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid | Addgene | pGBW-m4137382 | |
| steadylite plus Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6066759 | In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent' |
| Trypsin EDTA 1x | AUROGENE | AU-L0949-100 |
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