中和アッセイを介してSARS-CoV-2に対する体液性免疫応答を監視するための分子ツールとしての偽型ウイルス
Summary
偽型ウイルス(PV)は、複製欠損のあるウイルス粒子であり、本物のウイルスを扱うよりも安全な条件下で宿主とウイルスの相互作用を研究するために使用されます。ここでは、SARS-CoV-2 PVを使用して、COVID-19ワクチン接種後の患者の血清の中和能力をテストする方法を示す詳細なプロトコルを紹介します。
Abstract
シュードタイプウイルス(PV)は、宿主とウイルスの相互作用を研究し、血清サンプルの中和能力をテストするために使用できる分子ツールであり、目的遺伝子を送達するための遺伝子治療での使用がよく知られています。PVは、ウイルスゲノムがPVに取り込まれない異なるプラスミドに分割されているため、複製に欠陥があります。この安全で汎用性の高いシステムにより、バイオセーフティレベル2のラボでPVを使用できます。ここでは、ここで述べた3つのプラスミドに基づいてレンチウイルスPVを産生する一般的な方法論を提示します:(1)感染を監視するために必要なレポーター遺伝子を運ぶバックボーンプラスミド。(2)PVを生成するために必要なすべての構造タンパク質の遺伝子を運ぶパッケージングプラスミド。(3)ウイルスの向性を決定し、宿主細胞へのウイルスの侵入を媒介するエンベロープ表面の糖タンパク質発現プラスミド。この研究では、SARS-CoV-2スパイクは、非複製性SARS-CoV-2偽型レンチウイルスの産生に使用されるエンベロープ糖タンパク質です。
簡単に説明すると、パッケージング細胞(HEK293T)を標準的な方法を用いて3つの異なるプラスミドと同時トランスフェクションしました。48時間後、PVを含む上清を回収し、ろ過し、-80°Cで保存した。 SARS-CoV-2 PVの感染力は、感染後48時間後の標的細胞株におけるレポーター遺伝子(ルシフェラーゼ)の発現を調べることによってテストされました。相対発光単位(RLU)の値が高いほど、感染/形質導入率は高くなります。さらに、感染性PVを段階希釈した血清サンプルに添加して、偽ウイルスが標的細胞に侵入する中和プロセスを調べ、RLU強度の低下として測定しました。
Introduction
偽型ウイルス(PV)は、微生物学において宿主ウイルスおよび病原体と病原体の相互作用を研究するために使用される分子ツールです1,2,3,4。PVは、ウイルスゲノムを保護するウイルスコアである内側の部分と、ウイルスの表面にあるエンベロープ糖タンパク質である外側の部分から構成され、屈性を規定しています5。偽ウイルスは、新しいウイルス粒子を生成するためのすべての遺伝情報を含んでいないため、標的細胞内で複製する能力がありません。この独特な特徴の組み合わせにより、PVは野生型ウイルスの安全な代替品となります。一方、野生型ウイルスは病原性が高く、BSL2の検査室では分析に使用できない6。
PVの感染力は、通常、蛍光タンパク質(GFP、RFP、YFP)または化学発光産物を産生する酵素(ルシフェラーゼ)をコードするレポーター遺伝子によってモニターできます。これは、PV産生に用いられるプラスミドの1つに含まれ、偽ウイルス7のゲノムに組み込まれる。
現在、HIV-1ゲノムに基づくレンチウイルス由来の粒子など、いくつかの種類のPVコアが存在します。HIV-1ベースのPVが他のプラットフォームよりも優れている点は、標的細胞ゲノム8への本質的な統合プロセスです。HIV-1は感染力の強いウイルスであり、エイズの原因物質ですが、これらのレンチウイルスベクターは、長年にわたる広範な最適化ステップにより、安全に使用できます。最適な安全条件は、形質導入能力に影響を与えることなくウイルス遺伝子を枯渇させた第2世代レンチウイルスベクターの導入によって達成されました9。第3世代と第4世代は、ウイルスゲノムを別々のプラスミドにさらに分割することで、レンチウイルスベクターの取り扱いの安全性の向上に貢献しました10,11。最新世代のPVは、一般的に遺伝子治療用のレンチウイルスベクターの製造に用いられています。
PVは、ウイルスと宿主細胞の間の相互作用を研究するために、生産段階と感染段階の両方において使用できます。PVは、特に偽ウイルス中和アッセイ(PVNA)に用いられます。PVNAは、PVのエンベロープ上のウイルス糖タンパク質を標的とすることにより、血清または血漿の中和能を評価するために広く検証されています12,13。中和活性は、阻害濃度50(IC50)として表され、ウイルス粒子の侵入の50%を遮断する血清/血漿の希釈として定義される14。このプロトコルでは、ブースターワクチンの接種前後に採取した血清中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)に対する抗体活性をテストするためのPVNAのセットアップについて説明しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
野生型ウイルスの使用は実際の感染をシミュレートしますが、レンチウイルスPVは、病原性ウイルスを扱うために必要な厳格な安全要件なしに、ウイルスの侵入と感染に関連するメカニズムを研究するためのより安全な選択肢です4,20,21。PVは、複製欠損ウイルスコアと、本研究の目的である病原性ウイルスの表面エンベロ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、医療従事者のボランティアの貢献に感謝します。このプロジェクトは、イタリアのMURにあるDepartment of Excellence 2023/2027の支援を受けました。ARとDZはPRIN2022(EUの資金援助;ネクストジェネレーションEU)
Materials
| 0.45 μm filter | SARSTEDT | 83 1826 | |
| 6-well plate | SARSTEDT | 83 3920 | |
| 96-well plate | SARSTEDT | 8,33,924 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck | 10403892 | |
| Black Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 60005270 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | SIGMA-ALDRICH | D6546 – 500ML | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x) | AUROGENE | AU-L0615-500 | |
| Foetal Bovine Serum | AUROGENE | AU-S1810-500 | |
| Graphpad Prism version 7 | graphpad dotmatics | NA | In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program' |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEK293T/ACE2 cells | ATCC | CRL-3216 | HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector. |
| L-glutamine | AUROGENE | AU-X0550-100 | |
| Luminometer – Victor3 | Perkin Elmer | HH35000500 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'luminometer' |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium' |
| p8.91 packaging plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| pCSFLW reporter plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| Penicillin/streptomycin | AUROGENE | AU-L0022-100 | |
| Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa) | SIGMA-ALDRICH | 408727 | |
| RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) | Addgene | 145839 | This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2 |
| SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid | Addgene | pGBW-m4137382 | |
| steadylite plus Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6066759 | In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent' |
| Trypsin EDTA 1x | AUROGENE | AU-L0949-100 |
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