الفيروسات الزائفة (PVs) هي فيروسات معيبة في النسخ المتماثل تستخدم لدراسة تفاعلات الفيروس المضيف في ظل ظروف أكثر أمانا من التعامل مع الفيروسات الأصلية. يظهر هنا بروتوكول مفصل يوضح كيف يمكن استخدام SARS-CoV-2 PVs لاختبار قدرة مصل المرضى على التحييد بعد التطعيم ضد COVID-19.
الفيروسات الزائفة (PVs) هي أدوات جزيئية يمكن استخدامها لدراسة تفاعلات الفيروس المضيف واختبار القدرة المعادلة لعينات المصل ، بالإضافة إلى استخدامها المعروف في العلاج الجيني لتوصيل جين مهم. PVs معيبة في النسخ المتماثل لأن الجينوم الفيروسي ينقسم إلى بلازميدات مختلفة غير مدمجة في PVs. يسمح هذا النظام الآمن والمتعدد الاستخدامات باستخدام PVs في مختبرات مستوى السلامة البيولوجية 2. هنا ، نقدم منهجية عامة لإنتاج PVs lentiviral على أساس ثلاثة بلازميدات كما هو مذكور هنا: (1) البلازميد الفقري الذي يحمل جين المراسل اللازم لمراقبة العدوى. (2) بلازميد العبوة الذي يحمل الجينات لجميع البروتينات الهيكلية اللازمة لتوليد PVs ؛ (3) تعبير البروتين السكري السطحي المغلف البلازميد الذي يحدد انتحاء الفيروس ويتوسط الدخول الفيروسي إلى الخلية المضيفة. في هذا العمل ، SARS-CoV-2 Spike هو البروتين السكري المغلف المستخدم لإنتاج فيروسات عدسية غير متماثلة من النوع الكاذب SARS-CoV-2.
باختصار ، تم نقل خلايا التغليف (HEK293T) مع البلازميدات الثلاثة المختلفة باستخدام الطرق القياسية. بعد 48 ساعة ، تم حصاد المادة الطافية التي تحتوي على PVs وتصفيتها وتخزينها عند -80 درجة مئوية. تم اختبار عدوى SARS-CoV-2 PVs من خلال دراسة تعبير الجين المراسل (luciferase) في خط الخلية المستهدف بعد 48 ساعة من الإصابة. كلما زادت قيمة وحدات التلألؤ النسبية (RLUs) ، زاد معدل العدوى / النقل. علاوة على ذلك ، تمت إضافة PVs المعدية إلى عينات المصل المخففة بشكل متسلسل لدراسة عملية تحييد دخول الفيروسات الكاذبة إلى الخلايا المستهدفة ، والتي تم قياسها على أنها انخفاض في كثافة RLU: قيم أقل تتوافق مع نشاط تحييد عالي.
الفيروسات الزائفة (PVs) هي أدوات جزيئية تستخدم في علم الأحياء الدقيقة لدراسة تفاعلات الفيروس المضيف ومسببات الأمراضالممرضة 1،2،3،4. تتكون PVs من جزء داخلي ، النواة الفيروسية التي تحمي الجينوم الفيروسي ، وجزء خارجي ، البروتينات السكرية المغلفة على سطح الفيروس الذي يحدد الانتحاء5. الفيروس الكاذب غير كفء للتكاثر في الخلية المستهدفة لأنه لا يحتوي على جميع المعلومات الوراثية لتوليد جزيئات فيروسية جديدة. هذا المزيج من الميزات الغريبة يجعل PVs بديلا آمنا لفيروس من النوع البري. من ناحية أخرى ، فإن الفيروسات البرية شديدة الإمراض ولا يمكن استخدامها في مختبرات BSL 2 للتحليل6.
يمكن مراقبة عدوى PVs بواسطة جين مراسل ، وعادة ما يتم ترميزه لبروتين فلوري (GFP ، RFP ، YFP) أو إنزيم ينتج منتجات كيميائية مضيئة (luciferase). ويرد هذا في واحدة من البلازميدات المستخدمة لإنتاج الكهروضوئية ودمجها في جينوم الفيروس الكاذب7.
توجد حاليا عدة أنواع من النوى الكهروضوئية ، بما في ذلك الجسيمات المشتقة من العدس بناء على جينوم HIV-1. الميزة الكبيرة للخلايا الكهروضوئية القائمة على فيروس نقص المناعة البشرية -1 على المنصات الأخرى هي عملية التكامل الجوهرية في جينوم الخلية المستهدفة8. على الرغم من أن فيروس HIV-1 هو فيروس شديد العدوى وهو العامل المسبب للإيدز ، إلا أن هذه النواقل الفيروسية عدسية آمنة للاستخدام بسبب خطوات التحسين الواسعة النطاق على مر السنين. تم تحقيق ظروف السلامة المثلى مع إدخال 2 من ناقلات الفيروسات العدسية من الجيلالثاني ، حيث تم استنفاد الجينات الفيروسية دون التأثير على قدرات النقل9. ساهمالجيلين الثالث و 4 في زيادة سلامة التعامل مع ناقلات الفيروسات العدسية مع زيادة تقسيم الجينوم الفيروسي إلى بلازميدات منفصلة10,11. يتم استخدام أحدث أجيال من PVs بشكل عام لإنتاج ناقلات الفيروسات العدسية للعلاج الجيني.
يمكن استخدام PVs لدراسة التفاعلات بين الفيروسات والخلايا المضيفة ، خلال كل من مراحل الإنتاج والعدوى. تستخدم PVs بشكل خاص في مقايسات تحييد الفيروس الكاذب (PVNA). يتم التحقق من صحة PVNAs على نطاق واسع لتقييم إمكانات تحييد المصل أو البلازما من خلال استهداف البروتين السكري الفيروسي على غلاف PV12,13. يتم تعريف نشاط التحييد ، معبرا عنه بالتركيز المثبط 50 (IC50) ، على أنه تخفيف المصل / البلازما الذي يمنع 50٪ من دخول الجسيمات الفيروسية14. في هذا البروتوكول ، وصفنا إعداد PVNA لاختبار نشاط الأجسام المضادة ضد المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة – فيروس كورونا 2 (SARS-CoV-2) في الأمصال التي تم جمعها قبل وبعد تلقي جرعة لقاح معززة.
على الرغم من أن استخدام فيروس من النوع البري يحاكي العدوى الفعلية ، إلا أن الفيروسات العدسية PVs هي خيار أكثر أمانا لدراسة الآليات المرتبطة بدخول الفيروس والعدوى دون متطلبات السلامة الصارمة اللازمة للعمل مع الفيروسات المسببة للأمراض4،20،21</sup…
The authors have nothing to disclose.
ونعترف بمساهمة المتطوعين العاملين في مجال الرعاية الصحية. تم دعم هذا المشروع من قبل إدارة التميز 2023/2027 ، MUR ، إيطاليا. تم دعم AR و DZ من قبل PRIN2022 (تمويل الاتحاد الأوروبي; الجيل القادمالاتحاد الأوروبي)
0.45 μm filter | SARSTEDT | 83 1826 | |
6-well plate | SARSTEDT | 83 3920 | |
96-well plate | SARSTEDT | 8,33,924 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck | 10403892 | |
Black Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 60005270 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | SIGMA-ALDRICH | D6546 – 500ML | |
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x) | AUROGENE | AU-L0615-500 | |
Foetal Bovine Serum | AUROGENE | AU-S1810-500 | |
Graphpad Prism version 7 | graphpad dotmatics | NA | In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program' |
HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
HEK293T/ACE2 cells | ATCC | CRL-3216 | HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector. |
L-glutamine | AUROGENE | AU-X0550-100 | |
Luminometer – Victor3 | Perkin Elmer | HH35000500 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'luminometer' |
Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium' |
p8.91 packaging plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
pCSFLW reporter plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
Penicillin/streptomycin | AUROGENE | AU-L0022-100 | |
Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa) | SIGMA-ALDRICH | 408727 | |
RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) | Addgene | 145839 | This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2 |
SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid | Addgene | pGBW-m4137382 | |
steadylite plus Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6066759 | In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent' |
Trypsin EDTA 1x | AUROGENE | AU-L0949-100 |