Summary

الفيروسات الزائفة كأداة جزيئية لمراقبة الاستجابات المناعية الخلطية ضد SARS-CoV-2 عن طريق مقايسة التحييد

Published: November 21, 2023
doi:

Summary

الفيروسات الزائفة (PVs) هي فيروسات معيبة في النسخ المتماثل تستخدم لدراسة تفاعلات الفيروس المضيف في ظل ظروف أكثر أمانا من التعامل مع الفيروسات الأصلية. يظهر هنا بروتوكول مفصل يوضح كيف يمكن استخدام SARS-CoV-2 PVs لاختبار قدرة مصل المرضى على التحييد بعد التطعيم ضد COVID-19.

Abstract

الفيروسات الزائفة (PVs) هي أدوات جزيئية يمكن استخدامها لدراسة تفاعلات الفيروس المضيف واختبار القدرة المعادلة لعينات المصل ، بالإضافة إلى استخدامها المعروف في العلاج الجيني لتوصيل جين مهم. PVs معيبة في النسخ المتماثل لأن الجينوم الفيروسي ينقسم إلى بلازميدات مختلفة غير مدمجة في PVs. يسمح هذا النظام الآمن والمتعدد الاستخدامات باستخدام PVs في مختبرات مستوى السلامة البيولوجية 2. هنا ، نقدم منهجية عامة لإنتاج PVs lentiviral على أساس ثلاثة بلازميدات كما هو مذكور هنا: (1) البلازميد الفقري الذي يحمل جين المراسل اللازم لمراقبة العدوى. (2) بلازميد العبوة الذي يحمل الجينات لجميع البروتينات الهيكلية اللازمة لتوليد PVs ؛ (3) تعبير البروتين السكري السطحي المغلف البلازميد الذي يحدد انتحاء الفيروس ويتوسط الدخول الفيروسي إلى الخلية المضيفة. في هذا العمل ، SARS-CoV-2 Spike هو البروتين السكري المغلف المستخدم لإنتاج فيروسات عدسية غير متماثلة من النوع الكاذب SARS-CoV-2.

باختصار ، تم نقل خلايا التغليف (HEK293T) مع البلازميدات الثلاثة المختلفة باستخدام الطرق القياسية. بعد 48 ساعة ، تم حصاد المادة الطافية التي تحتوي على PVs وتصفيتها وتخزينها عند -80 درجة مئوية. تم اختبار عدوى SARS-CoV-2 PVs من خلال دراسة تعبير الجين المراسل (luciferase) في خط الخلية المستهدف بعد 48 ساعة من الإصابة. كلما زادت قيمة وحدات التلألؤ النسبية (RLUs) ، زاد معدل العدوى / النقل. علاوة على ذلك ، تمت إضافة PVs المعدية إلى عينات المصل المخففة بشكل متسلسل لدراسة عملية تحييد دخول الفيروسات الكاذبة إلى الخلايا المستهدفة ، والتي تم قياسها على أنها انخفاض في كثافة RLU: قيم أقل تتوافق مع نشاط تحييد عالي.

Introduction

الفيروسات الزائفة (PVs) هي أدوات جزيئية تستخدم في علم الأحياء الدقيقة لدراسة تفاعلات الفيروس المضيف ومسببات الأمراضالممرضة 1،2،3،4. تتكون PVs من جزء داخلي ، النواة الفيروسية التي تحمي الجينوم الفيروسي ، وجزء خارجي ، البروتينات السكرية المغلفة على سطح الفيروس الذي يحدد الانتحاء5. الفيروس الكاذب غير كفء للتكاثر في الخلية المستهدفة لأنه لا يحتوي على جميع المعلومات الوراثية لتوليد جزيئات فيروسية جديدة. هذا المزيج من الميزات الغريبة يجعل PVs بديلا آمنا لفيروس من النوع البري. من ناحية أخرى ، فإن الفيروسات البرية شديدة الإمراض ولا يمكن استخدامها في مختبرات BSL 2 للتحليل6.

يمكن مراقبة عدوى PVs بواسطة جين مراسل ، وعادة ما يتم ترميزه لبروتين فلوري (GFP ، RFP ، YFP) أو إنزيم ينتج منتجات كيميائية مضيئة (luciferase). ويرد هذا في واحدة من البلازميدات المستخدمة لإنتاج الكهروضوئية ودمجها في جينوم الفيروس الكاذب7.

توجد حاليا عدة أنواع من النوى الكهروضوئية ، بما في ذلك الجسيمات المشتقة من العدس بناء على جينوم HIV-1. الميزة الكبيرة للخلايا الكهروضوئية القائمة على فيروس نقص المناعة البشرية -1 على المنصات الأخرى هي عملية التكامل الجوهرية في جينوم الخلية المستهدفة8. على الرغم من أن فيروس HIV-1 هو فيروس شديد العدوى وهو العامل المسبب للإيدز ، إلا أن هذه النواقل الفيروسية عدسية آمنة للاستخدام بسبب خطوات التحسين الواسعة النطاق على مر السنين. تم تحقيق ظروف السلامة المثلى مع إدخال 2 من ناقلات الفيروسات العدسية من الجيلالثاني ، حيث تم استنفاد الجينات الفيروسية دون التأثير على قدرات النقل9. ساهمالجيلين الثالث و 4 في زيادة سلامة التعامل مع ناقلات الفيروسات العدسية مع زيادة تقسيم الجينوم الفيروسي إلى بلازميدات منفصلة10,11. يتم استخدام أحدث أجيال من PVs بشكل عام لإنتاج ناقلات الفيروسات العدسية للعلاج الجيني.

يمكن استخدام PVs لدراسة التفاعلات بين الفيروسات والخلايا المضيفة ، خلال كل من مراحل الإنتاج والعدوى. تستخدم PVs بشكل خاص في مقايسات تحييد الفيروس الكاذب (PVNA). يتم التحقق من صحة PVNAs على نطاق واسع لتقييم إمكانات تحييد المصل أو البلازما من خلال استهداف البروتين السكري الفيروسي على غلاف PV12,13. يتم تعريف نشاط التحييد ، معبرا عنه بالتركيز المثبط 50 (IC50) ، على أنه تخفيف المصل / البلازما الذي يمنع 50٪ من دخول الجسيمات الفيروسية14. في هذا البروتوكول ، وصفنا إعداد PVNA لاختبار نشاط الأجسام المضادة ضد المتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة – فيروس كورونا 2 (SARS-CoV-2) في الأمصال التي تم جمعها قبل وبعد تلقي جرعة لقاح معززة.

Protocol

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل اللجنة الأخلاقية بجامعة فيرونا ويتبع المبادئ التوجيهية لها (رقم بروتوكول الموافقة 1538). تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من الأشخاص المشاركين في الدراسة. تم جمع عينات الدم الكامل من متطوعي العاملين في مجال الرعاية الصحية (HCW) الذين كانوا بصدد تلقي لقا…

Representative Results

يصف هذا البروتوكول إنتاج الخلايا الكهروضوئية SARS-CoV-2 والتطبيق النهائي لهذه الخلايا الكهروضوئية لتحليل نشاط تحييد المصل / البلازما للأشخاص الذين يتلقون التطعيم المضاد ل COVID-1917. علاوة على ذلك ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول لإنتاج أنماط زائفة لكل متغير مثير للقلق SARS-CoV-2 (VOC) لاختبار ت…

Discussion

على الرغم من أن استخدام فيروس من النوع البري يحاكي العدوى الفعلية ، إلا أن الفيروسات العدسية PVs هي خيار أكثر أمانا لدراسة الآليات المرتبطة بدخول الفيروس والعدوى دون متطلبات السلامة الصارمة اللازمة للعمل مع الفيروسات المسببة للأمراض4،20،21</sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونعترف بمساهمة المتطوعين العاملين في مجال الرعاية الصحية. تم دعم هذا المشروع من قبل إدارة التميز 2023/2027 ، MUR ، إيطاليا. تم دعم AR و DZ من قبل PRIN2022 (تمويل الاتحاد الأوروبي; الجيل القادمالاتحاد الأوروبي)

Materials

0.45 μm filter SARSTEDT 83 1826
6-well plate SARSTEDT 83 3920
96-well plate SARSTEDT 8,33,924
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Merck 10403892
Black Opaque 96-well Microplate Perkin Elmer 60005270
Dulbecco's Modified Eagle Medium  SIGMA-ALDRICH D6546 – 500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x) AUROGENE AU-L0615-500
Foetal Bovine Serum AUROGENE AU-S1810-500
Graphpad Prism version 7 graphpad dotmatics NA In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program'
HEK293T cells ATCC CRL-3216
HEK293T/ACE2 cells ATCC CRL-3216 HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector.
L-glutamine  AUROGENE AU-X0550-100
Luminometer – Victor3 Perkin Elmer HH35000500 In the manuscript, we replace the commercial name with  'luminometer' 
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 11058021 In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium' 
p8.91 packaging plasmid Di Genova et al., 2021 A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
pCSFLW reporter plasmid Di Genova et al., 2021 A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
Penicillin/streptomycin AUROGENE AU-L0022-100
Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa) SIGMA-ALDRICH 408727
RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) Addgene 145839 This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2
SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid Addgene pGBW-m4137382
steadylite plus Reporter Gene Assay System Perkin Elmer 6066759 In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent'
Trypsin EDTA 1x AUROGENE AU-L0949-100

References

  1. Ozaki, D. A., et al. International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials. Plos One. 7 (1), e30963 (2012).
  2. Pouget, M., et al. Generation of liposomes to study the effect of Mycobacterium tuberculosis lipids on HIV-1 cis- and trans-infections. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1945 (2021).
  3. McKay, L. G. A., et al. The HCV envelope glycoprotein down-modulates NF-κB signalling and associates with stimulation of the host endoplasmic reticulum stress pathway. Frontiers in Immunology. 13, 831695 (2022).
  4. Xiang, Q., Li, L., Wu, J., Tian, M., Fu, Y. Application of pseudovirus system in the development of vaccine, antiviral-drugs, and neutralizing antibodies. Microbiological Research. 258, 126993 (2022).
  5. Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28, e1963 (2018).
  6. D’Apice, L., et al. Comparative analysis of the neutralizing activity against SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 strain and variants of concern: Performance evaluation of a pseudovirus-based neutralization assay. Frontiers in Immunology. 13, 981693 (2022).
  7. Falzarano, D., Groseth, A., Hoenen, T. Development and application of reporter-expressing mononegaviruses: current challenges and perspectives. Antiviral Research. 103, 78-87 (2014).
  8. Gutierrez-Guerrero, A., Cosset, F. -. L., Verhoeyen, E. Lentiviral vector pseudotypes: Precious tools to improve gene modification of hematopoietic cells for research and gene therapy. Viruses. 12, 1016 (2020).
  9. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
  10. Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. Journal of Virology. 72 (11), 8463-8471 (1998).
  11. Berkhout, B. A Fourth generation lentiviral Vector: Simplifying genomic gymnastics. Molecular Therapy. 25 (8), 1741-1743 (2017).
  12. Wu, X. Development and evaluation of a pseudovirus-luciferase assay for rapid and quantitative detection of neutralizing antibodies against Enterovirus 71. Plos One. 8 (6), e64116 (2013).
  13. Ferrara, F., et al. Development of lentiviral vectors pseudotyped with Influenza B hemagglutinins: application in vaccine immunogenicity, mAb potency, and sero-surveillance studies. Frontiers in Immunology. 12, 661379 (2021).
  14. Hu, J., et al. Development of cell-based pseudovirus entry assay to identify potential viral entry inhibitors and neutralizing antibodies against SARS-CoV-2. Genes & Diseases. 7 (4), 551-557 (2020).
  15. Dalle Carbonare, L., et al. Serology study after BTN162b2 vaccination in participants previously infected with SARS-CoV-2 in two different waves versus naïve. Communications Medicine. 1 (1), 38 (2021).
  16. Di Genova, C., et al. Production, titration, neutralisation, storage and lyophilisation of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) lentiviral pseudotypes. Bio-protocol. 11 (21), e4236 (2021).
  17. Chmielewska, A. M., Czarnota, A., Bieńkowska-Szewczyk, K., Grzyb, K. Immune response against SARS-CoV-2 variants: The role of neutralization assays. NPJ Vaccines. 6 (1), 1-8 (2021).
  18. Chen, Q., et al. Development and optimization of a sensitive pseudovirus-based assay for HIV-1 neutralizing antibodies detection using A3R5 cells. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (1), 199-208 (2018).
  19. Gauger, P. C., Vincent, A. L. Serum virus neutralization assay for detection and quantitation of serum neutralizing antibodies to influenza A virus in swine. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2123, 321-333 (2020).
  20. Miglietta, R., Pastori, C., Venuti, A., Ochsenbauer, C., Lopalco, L. Synergy in monoclonal antibody neutralization of HIV-1 pseudoviruses and infectious molecular clones. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 346 (2014).
  21. Chen, M., Zhang, X. -. E. Construction and applications of SARS-CoV-2 pseudoviruses: A mini review. International Journal of Biological Sciences. 17 (6), 1574-1580 (2021).
  22. Zipeto, D., et al. Induction of human immunodeficiency virus neutralizing antibodies using fusion complexes. Microbes and Infection. 8 (6), 1424-1433 (2006).
  23. WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. Available from: https://covid19.who.int (2022)
  24. Zhou, P. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 579 (7798), 270-273 (2020).
  25. Chen, X., Huang, H., Ju, J., Sun, R., Zhang, J. Impact of vaccination on the COVID-19 pandemic in U.S. states. Scientific Reports. 12 (1), 1554 (2022).
  26. Stefani, C., Fantoni, T., Bissoli, M., Thomas, J., Ruggiero, A. HIV and SARS-CoV-2 Co-Infection: From Population Study Evidence to In Vitro Studies. Life. 12 (12), 2089 (2022).
  27. Watson, O. J., et al. Global impact of the first year of COVID-19 vaccination: a mathematical modelling study. The Lancet Infectious Diseases. 22 (9), 1293-1302 (2022).
  28. Cantoni, D. Analysis of antibody neutralisation activity against SARS-CoV-2 variants and seasonal human coronaviruses NL63, HKU1, and 229E induced by three different COVID-19 vaccine olatforms. Vaccines. 11 (1), 58 (2023).
  29. Siracusano, G., et al. Different decay of antibody response and VOC sensitivity in naïve and previously infected subjects at 15 weeks following vaccination with BNT162b2. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 22 (2022).
  30. Ruggiero, A. SARS-CoV-2 vaccination elicits unconventional IgM specific responses in naïve and previously COVID-19-infected individuals. eBioMedicine. 77, (2022).
  31. Piubelli, C. Subjects who developed SARS-CoV-2 specific IgM after vaccination show a longer humoral immunity and a lower frequency of infection. eBioMedicine. 89, 104471 (2023).
  32. Zhang, G. F. Infectivity of pseudotyped SARS-CoV-2 variants of concern in different human cell types and inhibitory effects of recombinant spike protein and entry-related cellular factors. Journal of Medical Virology. 95 (1), e28437 (2023).
  33. da Costa, K. A. S. Influenza A (N1-N9) and Influenza B (B/Victoria and B/Yamagata) neuraminidase pseudotypes as tools for pandemic preparedness and improved influenza vaccine design. Vaccines. 10 (9), 1520 (2022).
  34. Condor Capcha, J. M. Generation of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus for viral entry and neutralization assays: a 1-week protocol. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 618651 (2021).
  35. Diomede, L., et al. Doxycycline inhibition of a pseudotyped virus transduction does not translate to inhibition of SARS-CoV-2 infectivity. Viruses. 13 (9), 1745 (2021).

Play Video

Cite This Article
Fantoni, T., Bissoli, M., Stefani, C., Voi, M., Dabija, A., Casula, R., Minafra, D. L., da Fonseca Palmeira, J., Argañaraz, E. R., Mayora-Neto, M., Temperton, N. J., Zipeto, D., Ruggiero, A. Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay. J. Vis. Exp. (201), e65658, doi:10.3791/65658 (2023).

View Video