Virus pseudotipados como herramienta molecular para monitorizar las respuestas inmunitarias humorales contra el SARS-CoV-2 mediante ensayo de neutralización
Summary
Los virus pseudotipados (PV) son viriones con replicación defectuosa que se utilizan para estudiar las interacciones huésped-virus en condiciones más seguras que la manipulación de virus auténticos. Aquí se presenta un protocolo detallado que muestra cómo se pueden usar los PV del SARS-CoV-2 para probar la capacidad neutralizante del suero de los pacientes después de la vacunación contra el COVID-19.
Abstract
Los virus pseudotipados (PV) son herramientas moleculares que se pueden utilizar para estudiar las interacciones huésped-virus y para probar la capacidad neutralizante de muestras de suero, además de su uso más conocido en terapia génica para la administración de un gen de interés. Los PV son defectuosos en la replicación porque el genoma viral se divide en diferentes plásmidos que no se incorporan a los PV. Este sistema seguro y versátil permite el uso de fotovoltaicos en laboratorios de nivel 2 de bioseguridad. Aquí, presentamos una metodología general para producir PVs lentivirales basada en tres plásmidos como se menciona aquí: (1) el plásmido de la columna vertebral que lleva el gen reportero necesario para monitorear la infección; (2) el plásmido de empaquetamiento que transporta los genes de todas las proteínas estructurales necesarias para generar las PV; (3) el plásmido de expresión de glicoproteínas de la superficie de la envoltura que determina el tropismo del virus y media la entrada del virus en la célula huésped. En este trabajo, la espícula del SARS-CoV-2 es la glicoproteína de la envoltura utilizada para la producción de lentivirus pseudotipados no replicativos del SARS-CoV-2.
Brevemente, las células de empaquetamiento (HEK293T) se transfectaron conjuntamente con los tres plásmidos diferentes utilizando métodos estándar. Después de 48 h, el sobrenadante que contenía los PV se recolectó, filtró y almacenó a -80 °C. La infectividad de los PV del SARS-CoV-2 se probó mediante el estudio de la expresión del gen reportero (luciferasa) en una línea celular diana 48 h después de la infección. Cuanto mayor sea el valor de las unidades de luminiscencia relativa (RLU), mayor será la tasa de infección/transducción. Además, los PV infecciosos se añadieron a las muestras de suero diluidas en serie para estudiar el proceso de neutralización de la entrada de los pseudovirus en las células diana, medido como la reducción de la intensidad de RLU: valores más bajos correspondientes a una alta actividad neutralizante.
Introduction
Los virus pseudotipados (PV) son herramientas moleculares utilizadas en microbiología para estudiar las interacciones huésped-virus y patógeno-patógeno 1,2,3,4. Los PV constan de una parte interna, el núcleo viral que protege el genoma viral, y una parte externa, las glicoproteínas de la envoltura en la superficie del virus que define el tropismo5. Un pseudovirus es incompetente para la replicación en la célula diana porque no contiene toda la información genética necesaria para generar nuevas partículas virales. Esta combinación de características peculiares hace que los PV sean una alternativa segura a un virus de tipo salvaje. Los virus de tipo salvaje, por otro lado, son altamente patógenos y no se pueden utilizar en los laboratorios BSL 2 para su análisis6.
La infectividad de las PV puede ser monitoreada por un gen reportero, generalmente codificando una proteína fluorescente (GFP, RFP, YFP) o una enzima que produce productos quimioluminiscentes (luciferasa). Este está contenido en uno de los plásmidos utilizados para la producción de PV e incorporado en el genoma del pseudovirus7.
Actualmente existen varios tipos de núcleos fotovoltaicos, incluidas las partículas derivadas de lentivirus basadas en el genoma del VIH-1. La gran ventaja de las PV basadas en VIH-1 frente a otras plataformas es su proceso de integración intrínseca en el genoma de la célula diana8. Aunque el VIH-1 es un virus altamente contagioso y es el agente causal del SIDA, estos vectores lentivirales son seguros de usar debido a los extensos pasos de optimización a lo largo de los años. Las condiciones óptimas de seguridad se lograron con la introducción de vectores lentivirales de2ª generación, en los que los genes virales se agotaron sin influir en las capacidades de transducción9. La3ª y4ª generación contribuyeron a aumentar la seguridad del manejo de vectores lentivirales con la división adicional del genoma viral en plásmidos separados10,11. Las últimas generaciones de PV se emplean generalmente para producir vectores lentivirales para la terapia génica.
Los PV se pueden utilizar para estudiar las interacciones entre los virus y las células huésped, tanto durante la fase de producción como durante la infección. Los PV se emplean especialmente en ensayos de neutralización de pseudovirus (PVNA). Los PVNA están ampliamente validados para evaluar el potencial de neutralización del suero o el plasma al dirigirse a la glicoproteína viral en la envoltura del PV12,13. La actividad de neutralización, expresada como la concentración inhibitoria 50 (IC50), se define como la dilución de suero/plasma que bloquea el 50% de la entrada de partículas virales14. En este protocolo, describimos la configuración de un PVNA para probar la actividad de anticuerpos contra el Síndrome Respiratorio Agudo Severo – Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) en sueros recolectados antes y después de recibir una dosis de vacuna de refuerzo.
Protocol
Representative Results
Discussion
A pesar de que el uso de un virus de tipo salvaje simula la infección real, los PV lentivirales son una opción más segura para estudiar los mecanismos asociados con la entrada e infección viral sin los estrictos requisitos de seguridad necesarios para trabajar con virus patógenos 4,20,21. Los PV están compuestos por un núcleo viral de replicación defectuosa rodeado por la glicoproteína de la envoltura superficial de un …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos la contribución de los trabajadores de la salud voluntarios. Este proyecto contó con el apoyo del Departamento de Excelencia 2023/2027, MUR, Italia. AR y DZ recibieron el apoyo de PRIN2022 (financiación de la UE; NextGenerationEU)
Materials
| 0.45 μm filter | SARSTEDT | 83 1826 | |
| 6-well plate | SARSTEDT | 83 3920 | |
| 96-well plate | SARSTEDT | 8,33,924 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck | 10403892 | |
| Black Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 60005270 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | SIGMA-ALDRICH | D6546 – 500ML | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x) | AUROGENE | AU-L0615-500 | |
| Foetal Bovine Serum | AUROGENE | AU-S1810-500 | |
| Graphpad Prism version 7 | graphpad dotmatics | NA | In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program' |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEK293T/ACE2 cells | ATCC | CRL-3216 | HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector. |
| L-glutamine | AUROGENE | AU-X0550-100 | |
| Luminometer – Victor3 | Perkin Elmer | HH35000500 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'luminometer' |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium' |
| p8.91 packaging plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| pCSFLW reporter plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| Penicillin/streptomycin | AUROGENE | AU-L0022-100 | |
| Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa) | SIGMA-ALDRICH | 408727 | |
| RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) | Addgene | 145839 | This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2 |
| SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid | Addgene | pGBW-m4137382 | |
| steadylite plus Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6066759 | In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent' |
| Trypsin EDTA 1x | AUROGENE | AU-L0949-100 |
References
- Ozaki, D. A., et al. International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials. Plos One. 7 (1), e30963 (2012).
- Pouget, M., et al. Generation of liposomes to study the effect of Mycobacterium tuberculosis lipids on HIV-1 cis- and trans-infections. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1945 (2021).
- McKay, L. G. A., et al. The HCV envelope glycoprotein down-modulates NF-κB signalling and associates with stimulation of the host endoplasmic reticulum stress pathway. Frontiers in Immunology. 13, 831695 (2022).
- Xiang, Q., Li, L., Wu, J., Tian, M., Fu, Y. Application of pseudovirus system in the development of vaccine, antiviral-drugs, and neutralizing antibodies. Microbiological Research. 258, 126993 (2022).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28, e1963 (2018).
- D’Apice, L., et al. Comparative analysis of the neutralizing activity against SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 strain and variants of concern: Performance evaluation of a pseudovirus-based neutralization assay. Frontiers in Immunology. 13, 981693 (2022).
- Falzarano, D., Groseth, A., Hoenen, T. Development and application of reporter-expressing mononegaviruses: current challenges and perspectives. Antiviral Research. 103, 78-87 (2014).
- Gutierrez-Guerrero, A., Cosset, F. -. L., Verhoeyen, E. Lentiviral vector pseudotypes: Precious tools to improve gene modification of hematopoietic cells for research and gene therapy. Viruses. 12, 1016 (2020).
- Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
- Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. Journal of Virology. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Berkhout, B. A Fourth generation lentiviral Vector: Simplifying genomic gymnastics. Molecular Therapy. 25 (8), 1741-1743 (2017).
- Wu, X. Development and evaluation of a pseudovirus-luciferase assay for rapid and quantitative detection of neutralizing antibodies against Enterovirus 71. Plos One. 8 (6), e64116 (2013).
- Ferrara, F., et al. Development of lentiviral vectors pseudotyped with Influenza B hemagglutinins: application in vaccine immunogenicity, mAb potency, and sero-surveillance studies. Frontiers in Immunology. 12, 661379 (2021).
- Hu, J., et al. Development of cell-based pseudovirus entry assay to identify potential viral entry inhibitors and neutralizing antibodies against SARS-CoV-2. Genes & Diseases. 7 (4), 551-557 (2020).
- Dalle Carbonare, L., et al. Serology study after BTN162b2 vaccination in participants previously infected with SARS-CoV-2 in two different waves versus naïve. Communications Medicine. 1 (1), 38 (2021).
- Di Genova, C., et al. Production, titration, neutralisation, storage and lyophilisation of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) lentiviral pseudotypes. Bio-protocol. 11 (21), e4236 (2021).
- Chmielewska, A. M., Czarnota, A., Bieńkowska-Szewczyk, K., Grzyb, K. Immune response against SARS-CoV-2 variants: The role of neutralization assays. NPJ Vaccines. 6 (1), 1-8 (2021).
- Chen, Q., et al. Development and optimization of a sensitive pseudovirus-based assay for HIV-1 neutralizing antibodies detection using A3R5 cells. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (1), 199-208 (2018).
- Gauger, P. C., Vincent, A. L. Serum virus neutralization assay for detection and quantitation of serum neutralizing antibodies to influenza A virus in swine. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2123, 321-333 (2020).
- Miglietta, R., Pastori, C., Venuti, A., Ochsenbauer, C., Lopalco, L. Synergy in monoclonal antibody neutralization of HIV-1 pseudoviruses and infectious molecular clones. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 346 (2014).
- Chen, M., Zhang, X. -. E. Construction and applications of SARS-CoV-2 pseudoviruses: A mini review. International Journal of Biological Sciences. 17 (6), 1574-1580 (2021).
- Zipeto, D., et al. Induction of human immunodeficiency virus neutralizing antibodies using fusion complexes. Microbes and Infection. 8 (6), 1424-1433 (2006).
- WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. Available from: https://covid19.who.int (2022)
- Zhou, P. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 579 (7798), 270-273 (2020).
- Chen, X., Huang, H., Ju, J., Sun, R., Zhang, J. Impact of vaccination on the COVID-19 pandemic in U.S. states. Scientific Reports. 12 (1), 1554 (2022).
- Stefani, C., Fantoni, T., Bissoli, M., Thomas, J., Ruggiero, A. HIV and SARS-CoV-2 Co-Infection: From Population Study Evidence to In Vitro Studies. Life. 12 (12), 2089 (2022).
- Watson, O. J., et al. Global impact of the first year of COVID-19 vaccination: a mathematical modelling study. The Lancet Infectious Diseases. 22 (9), 1293-1302 (2022).
- Cantoni, D. Analysis of antibody neutralisation activity against SARS-CoV-2 variants and seasonal human coronaviruses NL63, HKU1, and 229E induced by three different COVID-19 vaccine olatforms. Vaccines. 11 (1), 58 (2023).
- Siracusano, G., et al. Different decay of antibody response and VOC sensitivity in naïve and previously infected subjects at 15 weeks following vaccination with BNT162b2. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 22 (2022).
- Ruggiero, A. SARS-CoV-2 vaccination elicits unconventional IgM specific responses in naïve and previously COVID-19-infected individuals. eBioMedicine. 77, (2022).
- Piubelli, C. Subjects who developed SARS-CoV-2 specific IgM after vaccination show a longer humoral immunity and a lower frequency of infection. eBioMedicine. 89, 104471 (2023).
- Zhang, G. F. Infectivity of pseudotyped SARS-CoV-2 variants of concern in different human cell types and inhibitory effects of recombinant spike protein and entry-related cellular factors. Journal of Medical Virology. 95 (1), e28437 (2023).
- da Costa, K. A. S. Influenza A (N1-N9) and Influenza B (B/Victoria and B/Yamagata) neuraminidase pseudotypes as tools for pandemic preparedness and improved influenza vaccine design. Vaccines. 10 (9), 1520 (2022).
- Condor Capcha, J. M. Generation of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus for viral entry and neutralization assays: a 1-week protocol. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 618651 (2021).
- Diomede, L., et al. Doxycycline inhibition of a pseudotyped virus transduction does not translate to inhibition of SARS-CoV-2 infectivity. Viruses. 13 (9), 1745 (2021).
