Virus pseudotipizzati come strumento molecolare per monitorare le risposte immunitarie umorali contro SARS-CoV-2 tramite test di neutralizzazione
Summary
I virus pseudotipizzati (PV) sono virioni difettosi di replicazione che vengono utilizzati per studiare le interazioni ospite-virus in condizioni più sicure rispetto alla manipolazione di virus autentici. Di seguito è presentato un protocollo dettagliato che mostra come i PV SARS-CoV-2 possono essere utilizzati per testare la capacità neutralizzante del siero dei pazienti dopo la vaccinazione COVID-19.
Abstract
I virus pseudotipizzati (PV) sono strumenti molecolari che possono essere utilizzati per studiare le interazioni ospite-virus e per testare la capacità neutralizzante di campioni di siero, oltre al loro uso più noto nella terapia genica per la veicolazione di un gene di interesse. I PV sono difettosi di replicazione perché il genoma virale è diviso in diversi plasmidi che non sono incorporati nei PV. Questo sistema sicuro e versatile consente l’uso di PV in laboratori di livello di biosicurezza 2. Qui, presentiamo una metodologia generale per produrre PV lentivirali basata su tre plasmidi come menzionato qui: (1) il plasmide della spina dorsale che trasporta il gene reporter necessario per monitorare l’infezione; (2) il plasmide impacchettatore che trasporta i geni per tutte le proteine strutturali necessarie per generare le PVs; (3) il plasmide di espressione della glicoproteina superficiale dell’involucro che determina il trofismo del virus e media l’ingresso virale nella cellula ospite. In questo lavoro, SARS-CoV-2 Spike è la glicoproteina dell’involucro utilizzata per la produzione di lentivirus pseudotipizzati SARS-CoV-2 non replicati.
In breve, le cellule di impacchettamento (HEK293T) sono state co-trasfettate con i tre diversi plasmidi utilizzando metodi standard. Dopo 48 ore, il surnatante contenente i PV è stato raccolto, filtrato e conservato a -80 °C. L’infettività dei PV di SARS-CoV-2 è stata testata studiando l’espressione del gene reporter (luciferasi) in una linea cellulare bersaglio 48 ore dopo l’infezione. Maggiore è il valore delle unità di luminescenza relativa (RLU), maggiore è il tasso di infezione/trasduzione. Inoltre, i PV infettivi sono stati aggiunti ai campioni di siero diluiti in serie per studiare il processo di neutralizzazione dell’ingresso degli pseudovirus nelle cellule bersaglio, misurato come riduzione dell’intensità dell’RLU: valori più bassi corrispondenti a un’elevata attività neutralizzante.
Introduction
I virus pseudotipizzati (PV) sono strumenti molecolari utilizzati in microbiologia per studiare le interazioni ospite-virus e patogeno-patogeno 1,2,3,4. I PV sono costituiti da una parte interna, il nucleo virale che protegge il genoma virale, e da una parte esterna, le glicoproteine dell’involucro sulla superficie del virus che definisce il tropismo5. Uno pseudovirus è incompetente nella replicazione della cellula bersaglio perché non contiene tutte le informazioni genetiche per generare nuove particelle virali. Questa combinazione di caratteristiche peculiari rende i PV un’alternativa sicura a un virus wildtype. I virus wildtype, d’altra parte, sono altamente patogeni e non possono essere utilizzati nei laboratori BSL 2 per l’analisi6.
L’infettività delle PV può essere monitorata da un gene reporter, di solito codificante per una proteina fluorescente (GFP, RFP, YFP) o un enzima che produce prodotti chemiluminescenti (luciferasi). Questo è contenuto in uno dei plasmidi utilizzati per la produzione di PV e incorporato nel genoma dello pseudovirus7.
Attualmente esistono diversi tipi di nuclei fotovoltaici, comprese le particelle derivate da lentivirali basate sul genoma dell’HIV-1. Il grande vantaggio dei PV basati sull’HIV-1 rispetto ad altre piattaforme è il loro intrinseco processo di integrazione nel genoma della cellula bersaglio8. Sebbene l’HIV-1 sia un virus altamente contagioso e sia l’agente eziologico dell’AIDS, questi vettori lentivirali sono sicuri da usare grazie alle ampie fasi di ottimizzazione nel corso degli anni. Condizioni ottimali di sicurezza sono state raggiunte con l’introduzione di vettori lentivirali di seconda generazione, in cui i geni virali sono stati impoveriti senza influenzare le capacità di trasduzione9. La 3ae la 4a generazione hanno contribuito ad aumentare la sicurezza della manipolazione dei vettori lentivirali con l’ulteriore suddivisione del genoma virale in plasmidi separati10,11. Le ultime generazioni di PV sono generalmente impiegate per produrre vettori lentivirali per la terapia genica.
I PV possono essere utilizzati per studiare le interazioni tra virus e cellule ospiti, sia durante la fase di produzione che durante la fase di infezione. I PV sono particolarmente impiegati nei saggi di neutralizzazione degli pseudovirus (PVNA). I PVNA sono ampiamente validati per valutare il potenziale di neutralizzazione del siero o del plasma prendendo di mira la glicoproteina virale sull’involucro12,13 del PV. L’attività di neutralizzazione, espressa come concentrazione inibitoria 50 (IC50), è definita come la diluizione del siero/plasma che blocca il 50% dell’ingresso delle particelle virali14. In questo protocollo, abbiamo descritto la messa a punto di un PVNA per testare l’attività anticorpale contro la Sindrome Respiratoria Acuta Grave – Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in sieri raccolti prima e dopo aver ricevuto una dose di vaccino di richiamo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sebbene l’utilizzo di un virus wildtype simuli l’infezione effettiva, i PV lentivirali sono un’opzione più sicura per studiare i meccanismi associati all’ingresso e all’infezione virale senza i severi requisiti di sicurezza necessari per lavorare con i virus patogeni 4,20,21. I PV sono composti da un nucleo virale difettoso di replicazione circondato dalla glicoproteina dell’involucro superficiale di un virus patogeno che è l’…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo il contributo dei volontari degli operatori sanitari. Questo progetto è stato sostenuto dal Dipartimento di Eccellenza 2023/2027, MUR, Italia. AR e DZ sono stati sostenuti da PRIN2022 (finanziamenti dell’UE; NextGenerationEU)
Materials
| 0.45 μm filter | SARSTEDT | 83 1826 | |
| 6-well plate | SARSTEDT | 83 3920 | |
| 96-well plate | SARSTEDT | 8,33,924 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck | 10403892 | |
| Black Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 60005270 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | SIGMA-ALDRICH | D6546 – 500ML | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x) | AUROGENE | AU-L0615-500 | |
| Foetal Bovine Serum | AUROGENE | AU-S1810-500 | |
| Graphpad Prism version 7 | graphpad dotmatics | NA | In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program' |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEK293T/ACE2 cells | ATCC | CRL-3216 | HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector. |
| L-glutamine | AUROGENE | AU-X0550-100 | |
| Luminometer – Victor3 | Perkin Elmer | HH35000500 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'luminometer' |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium' |
| p8.91 packaging plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| pCSFLW reporter plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| Penicillin/streptomycin | AUROGENE | AU-L0022-100 | |
| Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa) | SIGMA-ALDRICH | 408727 | |
| RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) | Addgene | 145839 | This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2 |
| SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid | Addgene | pGBW-m4137382 | |
| steadylite plus Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6066759 | In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent' |
| Trypsin EDTA 1x | AUROGENE | AU-L0949-100 |
References
- Ozaki, D. A., et al. International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials. Plos One. 7 (1), e30963 (2012).
- Pouget, M., et al. Generation of liposomes to study the effect of Mycobacterium tuberculosis lipids on HIV-1 cis- and trans-infections. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1945 (2021).
- McKay, L. G. A., et al. The HCV envelope glycoprotein down-modulates NF-κB signalling and associates with stimulation of the host endoplasmic reticulum stress pathway. Frontiers in Immunology. 13, 831695 (2022).
- Xiang, Q., Li, L., Wu, J., Tian, M., Fu, Y. Application of pseudovirus system in the development of vaccine, antiviral-drugs, and neutralizing antibodies. Microbiological Research. 258, 126993 (2022).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28, e1963 (2018).
- D’Apice, L., et al. Comparative analysis of the neutralizing activity against SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 strain and variants of concern: Performance evaluation of a pseudovirus-based neutralization assay. Frontiers in Immunology. 13, 981693 (2022).
- Falzarano, D., Groseth, A., Hoenen, T. Development and application of reporter-expressing mononegaviruses: current challenges and perspectives. Antiviral Research. 103, 78-87 (2014).
- Gutierrez-Guerrero, A., Cosset, F. -. L., Verhoeyen, E. Lentiviral vector pseudotypes: Precious tools to improve gene modification of hematopoietic cells for research and gene therapy. Viruses. 12, 1016 (2020).
- Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
- Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. Journal of Virology. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Berkhout, B. A Fourth generation lentiviral Vector: Simplifying genomic gymnastics. Molecular Therapy. 25 (8), 1741-1743 (2017).
- Wu, X. Development and evaluation of a pseudovirus-luciferase assay for rapid and quantitative detection of neutralizing antibodies against Enterovirus 71. Plos One. 8 (6), e64116 (2013).
- Ferrara, F., et al. Development of lentiviral vectors pseudotyped with Influenza B hemagglutinins: application in vaccine immunogenicity, mAb potency, and sero-surveillance studies. Frontiers in Immunology. 12, 661379 (2021).
- Hu, J., et al. Development of cell-based pseudovirus entry assay to identify potential viral entry inhibitors and neutralizing antibodies against SARS-CoV-2. Genes & Diseases. 7 (4), 551-557 (2020).
- Dalle Carbonare, L., et al. Serology study after BTN162b2 vaccination in participants previously infected with SARS-CoV-2 in two different waves versus naïve. Communications Medicine. 1 (1), 38 (2021).
- Di Genova, C., et al. Production, titration, neutralisation, storage and lyophilisation of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) lentiviral pseudotypes. Bio-protocol. 11 (21), e4236 (2021).
- Chmielewska, A. M., Czarnota, A., Bieńkowska-Szewczyk, K., Grzyb, K. Immune response against SARS-CoV-2 variants: The role of neutralization assays. NPJ Vaccines. 6 (1), 1-8 (2021).
- Chen, Q., et al. Development and optimization of a sensitive pseudovirus-based assay for HIV-1 neutralizing antibodies detection using A3R5 cells. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (1), 199-208 (2018).
- Gauger, P. C., Vincent, A. L. Serum virus neutralization assay for detection and quantitation of serum neutralizing antibodies to influenza A virus in swine. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2123, 321-333 (2020).
- Miglietta, R., Pastori, C., Venuti, A., Ochsenbauer, C., Lopalco, L. Synergy in monoclonal antibody neutralization of HIV-1 pseudoviruses and infectious molecular clones. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 346 (2014).
- Chen, M., Zhang, X. -. E. Construction and applications of SARS-CoV-2 pseudoviruses: A mini review. International Journal of Biological Sciences. 17 (6), 1574-1580 (2021).
- Zipeto, D., et al. Induction of human immunodeficiency virus neutralizing antibodies using fusion complexes. Microbes and Infection. 8 (6), 1424-1433 (2006).
- WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. Available from: https://covid19.who.int (2022)
- Zhou, P. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 579 (7798), 270-273 (2020).
- Chen, X., Huang, H., Ju, J., Sun, R., Zhang, J. Impact of vaccination on the COVID-19 pandemic in U.S. states. Scientific Reports. 12 (1), 1554 (2022).
- Stefani, C., Fantoni, T., Bissoli, M., Thomas, J., Ruggiero, A. HIV and SARS-CoV-2 Co-Infection: From Population Study Evidence to In Vitro Studies. Life. 12 (12), 2089 (2022).
- Watson, O. J., et al. Global impact of the first year of COVID-19 vaccination: a mathematical modelling study. The Lancet Infectious Diseases. 22 (9), 1293-1302 (2022).
- Cantoni, D. Analysis of antibody neutralisation activity against SARS-CoV-2 variants and seasonal human coronaviruses NL63, HKU1, and 229E induced by three different COVID-19 vaccine olatforms. Vaccines. 11 (1), 58 (2023).
- Siracusano, G., et al. Different decay of antibody response and VOC sensitivity in naïve and previously infected subjects at 15 weeks following vaccination with BNT162b2. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 22 (2022).
- Ruggiero, A. SARS-CoV-2 vaccination elicits unconventional IgM specific responses in naïve and previously COVID-19-infected individuals. eBioMedicine. 77, (2022).
- Piubelli, C. Subjects who developed SARS-CoV-2 specific IgM after vaccination show a longer humoral immunity and a lower frequency of infection. eBioMedicine. 89, 104471 (2023).
- Zhang, G. F. Infectivity of pseudotyped SARS-CoV-2 variants of concern in different human cell types and inhibitory effects of recombinant spike protein and entry-related cellular factors. Journal of Medical Virology. 95 (1), e28437 (2023).
- da Costa, K. A. S. Influenza A (N1-N9) and Influenza B (B/Victoria and B/Yamagata) neuraminidase pseudotypes as tools for pandemic preparedness and improved influenza vaccine design. Vaccines. 10 (9), 1520 (2022).
- Condor Capcha, J. M. Generation of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus for viral entry and neutralization assays: a 1-week protocol. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 618651 (2021).
- Diomede, L., et al. Doxycycline inhibition of a pseudotyped virus transduction does not translate to inhibition of SARS-CoV-2 infectivity. Viruses. 13 (9), 1745 (2021).
