דגימת נוזל מוחי ודם מווריד זנב לטרלי בחולדות במהלך רישומי EEG
Summary
הפרוטוקול מראה איסוף חוזר של נוזל המוח השדרה ודם מחולדות אפילפטיות, המבוצע במקביל לניטור וידאו-אלקטרואנצפלוגרם רציף (EEG). אלה חיוניים לחקר קשרים אפשריים בין שינויים במולקולות שונות של נוזל הגוף לבין פעילות התקפים.
Abstract
מכיוון שהרכב נוזלי הגוף משקף דינמיקות פיזיולוגיות ופתולוגיות רבות, דגימות נוזל ביולוגיות מתקבלות בדרך כלל בהקשרים ניסיוניים רבים כדי למדוד מולקולות מעניינות, כגון הורמונים, גורמי גדילה, חלבונים או רנ”א קטנים שאינם מקודדים. דוגמה ספציפית היא דגימה של נוזלים ביולוגיים במחקר של סמנים ביולוגיים לאפילפסיה. במחקרים אלה, רצוי להשוות את רמות המולקולות בנוזל השדרה (CSF) ובפלזמה, על ידי משיכת CSF ופלזמה במקביל והתחשבות במרחק הזמן של הדגימה מהתקפים ואליהם. הדגימה המשולבת של CSF ופלזמה, יחד עם ניטור וידאו-EEG בבעלי חיים אפילפטיים, היא גישה מבטיחה לאימות של סמנים ביולוגיים אבחוניים ופרוגנוסטיים משוערים. כאן מתואר הליך של נסיגה משולבת של CSF מ- cisterna magna ודגימת דם מווריד הזנב הצידי בחולדות אפילפטיות המנוטרות באופן רציף באמצעות וידאו EEG. הליך זה מציע יתרונות משמעותיים על פני טכניקות נפוצות אחרות. הוא מאפשר דגימה מהירה עם מינימום כאב או פולשניות, וקיצור זמן ההרדמה. בנוסף, ניתן להשתמש בו כדי להשיג דגימות CSF ופלזמה הן בחולדות קשוחות והן בחולדות שנרשמו באמצעות טלמטריה, וניתן להשתמש בו שוב ושוב במשך מספר ימי ניסוי. על ידי מזעור הלחץ כתוצאה מהדגימה על ידי קיצור הרדמה איזופלורנית, המדדים צפויים לשקף בצורה מדויקת יותר את הרמות האמיתיות של מולקולות נחקרות בנוזלים ביולוגיים. בהתאם לזמינות של בדיקה אנליטית מתאימה, טכניקה זו עשויה לשמש למדידת רמות של מולקולות מרובות ושונות תוך ביצוע רישום EEG בו זמנית.
Introduction
נוזל מוחי שדרתי (CSF) ודגימת דם חשובים לזיהוי ואימות סמנים ביולוגיים של אפילפסיה, הן במחקר פרה-קליני והן במחקר קליני 1,2. כיום, האבחנה של אפילפסיה ורוב המחקר על סמנים ביולוגיים של אפילפסיה מתמקדים ב- EEG והדמיה מוחית 3,4,5. גישות אלה, עם זאת, מציבות מספר מגבלות. מלבד מדידות שגרתיות בקרקפת, במקרים רבים, EEG דורש טכניקות פולשניות כמו אלקטרודות עומק6. שיטות הדמיה מוחית הן בעלות רזולוציה טמפורלית ומרחבית ירודה והן יקרות יחסית וגוזלות זמן 7,8. מסיבה זו, זיהוי סמנים ביולוגיים לא פולשניים, בעלות נמוכה ומבוססי נוזל ביולוגי יספק חלופה אטרקטיבית מאוד. בנוסף, סמנים ביולוגיים אלה של נוזל ביולוגי יכולים להיות משולבים עם גישות אבחון זמינות כדי לחדד את יכולת החיזוי שלהם.
חולים המאובחנים עם אפילפסיה נשלחים באופן שגרתי לדגימת EEG 9,10 ולדגימת דם 11,12,13,14, ורבים גם לנסיגה CSF כדי לשלול סיבות מסכנות חיים (כלומר, זיהומים חריפים, דלקת מוח אוטואימונית)15. דגימות דם ו- CSF אלה יכולות לשמש במחקר קליני שמטרתו לזהות סמנים ביולוגיים לאפילפסיה. לדוגמה, הוג ועמיתיו מצאו כי עלייה בשלושה מקטעי tRNA פלזמה קודמת להתרחשות התקף באפילפסיה אנושית14. באופן דומה, רמות אינטרלוקין-1beta (IL-1β) ב- CSF ובנסיוב אנושי, המבוטאות ביחס בין רמות IL-1β ב- CSF על פני סרום, יכולות לנבא התפתחות אפילפסיה פוסט-טראומטית לאחר פגיעה מוחית טראומטית16. מחקרים אלה מדגישים את החשיבות של דגימת נוזלים ביולוגיים למחקר סמנים ביולוגיים לאפילפסיה, אך הם מתמודדים עם מגבלות מרובות המהותיות לניסויים קליניים, למשל, הגורם המייסד של תרופות אנטי אפילפטיות (AEDs) בדם, היעדר תכוף של מידע אטיולוגי, בקרות לא מספקות, מספר צנוע של חולים, ואחרים17,18.
מחקר פרה-קליני מציע הזדמנויות אחרות לחקר מולקולות בנוזלים ביולוגיים כסמנים ביולוגיים פוטנציאליים לאפילפסיה. למעשה, ניתן למשוך פלזמה ו / או CSF מבעלי חיים בעת ביצוע הקלטות EEG. יתר על כן, ניתן לבצע דגימה שוב ושוב לאורך מספר ימים של הניסוי, וניתן להשתמש במספר בקרות תואמות גיל, מין ועלבון אפילפטי כדי לשפר את עמידות המחקר. כאן, טכניקה גמישה כדי לקבל CSF מ cisterna magna עם נסיגה מקבילה של פלזמה מן הווריד הזנב חולדות EEG מנוטר מתואר בפירוט. לטכניקה המוצגת מספר יתרונות על פני שיטות חלופיות. על ידי שימוש בגישת מחט פרפר, ניתן לאסוף CSF מספר פעמים מבלי לפגוע בתפקוד של אלקטרודות EEG או שתלי ראש דומים. זה מייצג שכלול של הליכי גמילה קטטר intrathecal, אשר קשורים עם סיכון גבוה יחסית של זיהום. בנוסף, גישת הנפילה החופשית המדווחת המשמשת לאיסוף דם עדיפה על גישות אחרות של נסיגת דם מווריד הזנב בגלל הסיכון המופחת ביותר להמוליזה, בשל העובדה שהדם אינו עובר דרך צינורות ולא מופעל לחץ ואקום. אם מבוצע בתנאים קפדניים ללא חיידקים, קיים סיכון נמוך במיוחד להדבקה עבור בעלי חיים. בנוסף, על ידי התחלת משיכת הדם ממש בקצה זנבות החיות, ניתן לחזור על הדגימה מספר פעמים. טכניקות כאלה קל לשלוט והוא יכול להיות מיושם במחקרים פרה-קליניים רבים של הפרעות במערכת העצבים המרכזית.
Protocol
Representative Results
Discussion
העבודה הנוכחית מדגימה טכניקה קלה לשליטה של CSF ואיסוף דם בחולדות, אשר עשויה להיות שימושית לא רק למחקרים במודלים של אפילפסיה אלא גם של מצבים נוירולוגיים אחרים או מחלות כגון אלצהיימר, פרקינסון או טרשת נפוצה. במחקר אפילפסיה, שני הליכי הדגימה יחד עם וידאו-EEG הם אידיאליים כאשר מחפשים מתאם בין רמו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענק מתוכנית העבודה Horizon 2020 של האיחוד האירופי (התקשר H2020-FETOPEN-2018-2020) במסגרת הסכם מענק 964712 (PRIME; ל- M. Simonato).
Materials
| Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok | BD Italy SpA, Milan, Italy | 367246 | Material |
| Blood Collection tubes (Microtainer K2E) | BD Italy SpA, Milan, Italy | 365975 | Material |
| Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm | Nipro, Osaka, Japan | PSY-23-ET-ICU | Material |
| Centrifuge refrigerated ALC PK 130R | DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England | 112000033 | Material |
| Cotton suture 3-0 | Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA | 7343H | Material |
| Diazepam 5 mg/2ml, Solupam | Dechra Veterinary Products, Torino, Italy | 105183014 (AIC) | Solution |
| Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | PNM-VIDEO-008 | Equipment |
| Digital video surveillance system of tethered EEG set up | EZVIZ Network, Hangzhou, Cina | EZVIZ (V5.3.2) | Equipment |
| Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity | Laboratoire Garcin-Bactinyl, France | LB 920111 | Solution |
| Dummy guide cannula 8 mm | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | CXD-8 | Material |
| Electrode 3-channel two-twisted | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA | MS333/3-B/SPC | Material |
| Electrode holder for stereotxic surgery | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | 1776-P1 | Equipment |
| Eppendorf BioSpectrometer basic | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6137 | Equipment |
Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL |
Eppendorf Srl, Milan, Italy | 30124332 | Material |
| Eppendorf μCuvette G1.0 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6138 | Equipment |
| Feeding needle flexible 17G for rat | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 7206 | Material |
| Grass Technology apparatus | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA | M665G08 | Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40) |
| Isoflurane 100%, IsoFlo | Zoetis, Rome, Italy | 103287025 (AIC) | Solution |
| Ketamine (Imalgene) | Merial, Toulouse, France | 221300288 (AIC) | Solution |
| Lithium chloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | L9650 | Material |
| Microinjection cannula 31G 9 mm | Agn Tho's, Lindigö Sweden | CXMI-9 | Material |
| MP150 modular data acquisition and analysis system | Biopac, Goleta, California, USA | MP150WSW | Equipment |
| Ophthalmic vet ointment, Hylo night | Ursapharm, Milan, Italy | 941791927 (AIC) | Material |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | P6503 | Material |
| PTFE Tube with joint | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | JT-10 | Material |
| Saline | 0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0 | Solution | |
| Scopolamine hydrobromide trihydrate | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S2250 | Material |
| Scopolamine methyl nitrate | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S1876 | Material |
| Silver sulfadiazine 1% cream | Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy | 025561010 (AIC) | Material |
| Simplex rapid dental methacrylic cement | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom | ACR811 | Material |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA | Model 963 | Equipment |
| Sucrose solution | 10% sucrose in distilled water | Home-made | Solution |
| Syringe 1 mL | Biosigma, Cona, Venezia, Italy | 20,71,26,03,00,350 | Material |
| Telemeters | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | CTA-F40 | Material |
| Telemetry EEG traces analyzer | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | NeuroScore v3-0 | Equipment |
| Telemetry system | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | Hardware plus software Ponemah core 6.51 | Equipment |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | X1251 | Material |
References
- Hanin, A., et al. Cerebrospinal fluid and blood biomarkers of status epilepticus. Epilepsia. 61 (1), 6-18 (2020).
- Pitkänen, A., et al. Advances in the development of biomarkers for epilepsy. The Lancet Neurology. 15 (8), 843-856 (2016).
- Dlugos, D., et al. Childhood Absence Epilepsy Study Team (2013). Pretreatment EEG in childhood absence epilepsy: associations with attention and treatment outcome. Neurology. 81 (2), 150-156 (2013).
- Lorenzo, N. Y., et al. Intractable frontal lobe epilepsy: pathological and MRI features. Epilepsy research. 20 (2), 171-178 (1995).
- van Dellen, E., et al. Epilepsy surgery outcome and functional network alterations in longitudinal MEG: a minimum spanning tree analysis. NeuroImage. 86, 354-363 (2014).
- Shah, A. K., Mittal, S. Invasive electroencephalography monitoring: Indications and presurgical planning. Annals of Indian Academy of Neurology. 17 (Suppl 1), S89-S94 (2014).
- Whiting, P., et al. A systematic review of the effectiveness and cost-effectiveness of neuroimaging assessments used to visualise the seizure focus in people with refractory epilepsy being considered for surgery. Health technology assessment. 10 (4), 1-iv (2006).
- Lenkov, D. N., Volnova, A. B., Pope, A. R., Tsytsarev, V. Advantages and limitations of brain imaging methods in the research of absence epilepsy in humans and animal models. Journal of neuroscience methods. 212 (2), 195-202 (2013).
- Leach, J. P., Stephen, L. J., Salveta, C., Brodie, M. J. Which electroencephalography (EEG) for epilepsy? The relative usefulness of different EEG protocols in patients with possible epilepsy. Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry. 77 (9), 1040-1042 (2006).
- Huppertz, H. J., et al. Localization of interictal delta and epileptiform EEG activity associated with focal epileptogenic brain lesions. NeuroImage. 13 (1), 15-28 (2001).
- Linder, C., et al. Comparison between dried blood spot and plasma sampling for therapeutic drug monitoring of antiepileptic drugs in children with epilepsy: A step towards home sampling. Clinical biochemistry. 50 (7-8), 418-424 (2017).
- Wegner, I., Wilhelm, A. J., Lambrechts, D. A., Sander, J. W., Lindhout, D. Effect of oral contraceptives on lamotrigine levels depends on comedication. Acta neurologica Scandinavica. 129 (6), 393-398 (2014).
- Palmio, J., et al. CSF and plasma adipokines after tonic-clonic seizures. Seizure. 39, 10-12 (2016).
- Hogg, M. C., et al. Elevation in plasma tRNA fragments precede seizures in human epilepsy. Journal of Clinical Investigation. 129 (7), 2946-2951 (2019).
- Ellul, M., Solomon, T. Acute encephalitis – diagnosis and management. Clinical medicine. 18 (2), 155-159 (2018).
- Diamond, M. L., et al. IL-1β associations with posttraumatic epilepsy development: a genetics and biomarker cohort study. Epilepsia. 55 (7), 1109-1119 (2014).
- Auvin, S., et al. Prospective clinical trials to investigate clinical and molecular biomarkers. Epilepsia. 58 (Suppl 3), 20-26 (2017).
- Weber, Y. G., Nies, A. T., Schwab, M., Lerche, H. Genetic biomarkers in epilepsy. Neurotherapeutics. 11 (2), 324-333 (2014).
- Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. Journal of Visualized Experiments. (59), e3528 (2012).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880 (2008).
- Gardiner, T. W., Toth, L. A. Stereotactic Surgery and Long-Term Maintenance of Cranial Implants in Research Animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 38 (1), 56-63 (1999).
- Westergren, I., Johansson, B. B. Changes in physiological parameters of rat cerebrospinal fluid during chronic sampling: evaluation of two sampling methods. Brain Research Bulletin. 27 (2), 283-286 (1991).
- Soukupová, M., et al. Impairment of GABA release in the hippocampus at the time of the first spontaneous seizure in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Experimental Neurology. 257, 39-49 (2014).
- Soukupová, M., et al. Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58455 (2018).
- Guarino, A., et al. Low-dose 7,8-Dihydroxyflavone Administration After Status Epilepticus Prevents Epilepsy Development. Neurotherapeutics. 19 (6), 1951-1965 (2022).
- Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S. G., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
- Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation: II. Motor seizure. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 32 (3), 281-294 (1972).
- Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
- . Blood sampling: Rat Available from: https://nc3rs.org.uk/3rs-resources/blood-sampling/blood-sampling-rat (2022)
- Powles-Glover, N., Kirk, S., Wilkinson, C., Robinson, S., Stewart, J. Assessment of toxicological effects of blood microsampling in the vehicle dosed adult rat. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 68 (3), 325-331 (2014).
- Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animal. 32 (4), 369-376 (1998).
- Wang, D., Zhao, Y., Yang, Y., Xie, H. Safety assessment of multiple repeated percutaneous punctures for the collection of cerebrospinal fluid in rats. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 54 (6), e10032 (2021).
- Möller, C., et al. Impact of repeated kindled seizures on heart rate rhythms, heart rate variability, and locomotor activity in rats. Epilepsy & Behavior. 92, 36-44 (2019).
- Espinosa-Garcia, C., Zeleke, H., Rojas, A. Impact of Stress on Epilepsy: Focus on Neuroinflammation-A Mini Review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 4061 (2021).
- Cassar, S. C., et al. Comparing levels of biochemical markers in CSF from cannulated and non-cannulated rats. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 249-253 (2010).
- Huang, Y. L., Säljö, A., Suneson, A., Hansson, H. A. Comparison among different approaches for sampling cerebrospinal fluid in rats. Brain Research Bulletin. 41 (5), 273-279 (1996).
- Hattori, N., Takumi, A., Saito, K., Saito, Y. Effects of serial cervical or tail blood sampling on toxicity and toxicokinetic evaluation in rats. Journal of Toxicological Sciences. 45 (10), 599-609 (2020).
- Roncon, P., et al. MicroRNA profiles in hippocampal granule cells and plasma of rats with pilocarpine-induced epilepsy–comparison with human epileptic samples. Scientific Reports. 5, 14143 (2015).
- van Vliet, E. A., et al. Standardization procedure for plasma biomarker analysis in rat models of epileptogenesis: Focus on circulating microRNAs. Epilepsia. 58 (12), 2013-2024 (2017).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6 (9), e24145 (2011).
- Grimm, H., et al. Advancing the 3Rs: innovation, implementation, ethics and society. Frontiers in Veterinary Science. 10, 1185706 (2023).
