Prélèvement de liquide céphalorachidien et de sang de la veine caudale latérale chez le rat pendant les enregistrements EEG
Summary
Le protocole montre des prélèvements répétés de liquide céphalorachidien et de sang de rats épileptiques effectués en parallèle avec une surveillance continue du vidéo-électroencéphalogramme (EEG). Ceux-ci sont essentiels pour explorer les liens possibles entre les changements dans diverses molécules de fluides corporels et l’activité convulsive.
Abstract
Parce que la composition des fluides corporels reflète de nombreuses dynamiques physiologiques et pathologiques, des échantillons de liquides biologiques sont couramment obtenus dans de nombreux contextes expérimentaux pour mesurer des molécules d’intérêt, telles que des hormones, des facteurs de croissance, des protéines ou de petits ARN non codants. Un exemple concret est l’échantillonnage de liquides biologiques dans la recherche de biomarqueurs de l’épilepsie. Dans ces études, il est souhaitable de comparer les niveaux de molécules dans le liquide céphalorachidien (LCR) et dans le plasma, en prélevant le LCR et le plasma en parallèle et en tenant compte de la distance temporelle de l’échantillonnage entre et les crises. La combinaison de l’échantillonnage du LCR et du plasma, couplée à la surveillance vidéo-EEG chez les animaux épileptiques, est une approche prometteuse pour la validation de biomarqueurs diagnostiques et pronostiques putatifs. Ici, une procédure de retrait combiné du LCR de la citerne magna et d’un prélèvement sanguin de la veine latérale de la queue chez des rats épileptiques qui sont surveillés en permanence par vidéo-EEG est décrite. Cette procédure offre des avantages significatifs par rapport à d’autres techniques couramment utilisées. Il permet un prélèvement rapide avec un minimum de douleur ou d’invasivité, et une durée d’anesthésie réduite. De plus, il peut être utilisé pour obtenir des échantillons de LCR et de plasma chez des rats captifs et enregistrés par télémétrie EEG, et il peut être utilisé à plusieurs reprises sur plusieurs jours d’expérience. En minimisant le stress dû à l’échantillonnage en raccourcissant l’anesthésie à l’isoflurane, on s’attend à ce que les mesures reflètent plus précisément les niveaux réels des molécules étudiées dans les biofluides. En fonction de la disponibilité d’un test analytique approprié, cette technique peut être utilisée pour mesurer les niveaux de plusieurs molécules différentes tout en effectuant un enregistrement EEG en même temps.
Introduction
Le liquide céphalorachidien (LCR) et les prélèvements sanguins sont importants pour identifier et valider les biomarqueurs de l’épilepsie, tant dans la recherche préclinique que clinique 1,2. De nos jours, le diagnostic de l’épilepsie et la plupart des recherches sur les biomarqueurs de l’épilepsie se concentrent sur l’EEG et la neuroimagerie 3,4,5. Ces approches présentent toutefois plusieurs limites. Outre les mesures de routine du cuir chevelu, dans de nombreux cas, l’EEG nécessite des techniques invasives telles que les électrodes de profondeur6. Les méthodes d’imagerie cérébrale ont une faible résolution temporelle et spatiale et sont relativement coûteuses et prennent beaucoup de temps 7,8. Pour cette raison, l’identification de biomarqueurs non invasifs, peu coûteux et à base de biofluides constituerait une alternative très intéressante. De plus, ces biomarqueurs biofluides pourraient être combinés avec les approches diagnostiques disponibles pour affiner leur prédictivité.
Les patients diagnostiqués avec l’épilepsie sont systématiquement soumis à un EEG 9,10 et à des prélèvements sanguins 11,12,13,14, et beaucoup d’entre eux sont également soumis à un retrait du LCR pour exclure les causes potentiellement mortelles (c’est-à-dire les infections aiguës, l’encéphalite auto-immune)15. Ces échantillons de sang et de LCR peuvent être utilisés dans la recherche clinique visant à identifier des biomarqueurs de l’épilepsie. Par exemple, Hogg et ses collègues ont découvert qu’une augmentation de trois fragments d’ARNt plasmatiques précède l’apparition de crises dans l’épilepsie humaine14. De même, les taux d’interleukine-1bêta (IL-1β) dans le LCR humain et le sérum, exprimés par le rapport des taux d’IL-1β dans le LCR par rapport au sérum, peuvent prédire le développement de l’épilepsie post-traumatique après un traumatisme crânien16. Ces études soulignent l’importance de l’échantillonnage des biofluides pour la recherche sur les biomarqueurs de l’épilepsie, mais elles se heurtent à de multiples limites intrinsèques aux essais cliniques, par exemple, le facteur cofondateur des médicaments antiépileptiques (DEA) dans le sang, le manque fréquent d’informations sur l’étiologie, les contrôles inadéquats, le nombre modeste de patients, etc. 17,18.
La recherche préclinique offre d’autres possibilités d’étudier les molécules dans les biofluides en tant que biomarqueurs potentiels de l’épilepsie. En fait, il est possible de prélever du plasma et/ou du LCR sur des animaux lors d’enregistrements EEG. De plus, l’échantillonnage peut être effectué à plusieurs reprises sur plusieurs jours de l’expérience, et un certain nombre de témoins appariés en fonction de l’âge, du sexe et de l’agression épileptique peuvent être utilisés pour améliorer la robustesse de l’étude. Ici, une technique flexible pour obtenir du LCR à partir de la citerne magna avec retrait parallèle de plasma de la veine caudale chez des rats surveillés par EEG est décrite en détail. La technique présentée présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes alternatives. En utilisant une approche à l’aiguille papillon, il est possible de prélever plusieurs fois le LCR sans compromettre la fonction des électrodes EEG ou des implants crâniens similaires. Il s’agit d’un raffinement des procédures de retrait des cathéters intrathécaux, qui sont associées à un risque relativement élevé d’infection. De plus, l’approche de chute libre utilisée pour le prélèvement sanguin est supérieure aux autres approches de prélèvement sanguin dans la veine caudale en raison du risque d’hémolyse très réduit, dû au fait que le sang ne passe pas à travers la tubulure et qu’aucune pression de vide n’est appliquée. S’il est effectué dans des conditions strictes exemptes de germes, le risque d’infection est particulièrement faible pour les animaux. De plus, en commençant les prélèvements sanguins à l’extrémité de la queue des animaux, les prélèvements peuvent être répétés plusieurs fois. Ces techniques sont faciles à maîtriser et peuvent être appliquées dans de nombreuses études précliniques sur les troubles du système nerveux central.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le présent travail illustre une technique facile à maîtriser de LCR et de prélèvement sanguin chez le rat, qui peut être utile non seulement pour des études sur des modèles d’épilepsie, mais aussi pour d’autres affections ou maladies neurologiques telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson ou la sclérose en plaques. Dans la recherche sur l’épilepsie, les deux procédures d’échantillonnage couplées à l’EEG vidéo sont idéales lorsqu’une corrélation entre les niveaux de différ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par une subvention du programme de travail Horizon 2020 de l’Union européenne (appel H2020-FETOPEN-2018-2020) dans le cadre de la convention de subvention 964712 (PRIME ; à M. Simonato).
Materials
| Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok | BD Italy SpA, Milan, Italy | 367246 | Material |
| Blood Collection tubes (Microtainer K2E) | BD Italy SpA, Milan, Italy | 365975 | Material |
| Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm | Nipro, Osaka, Japan | PSY-23-ET-ICU | Material |
| Centrifuge refrigerated ALC PK 130R | DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England | 112000033 | Material |
| Cotton suture 3-0 | Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA | 7343H | Material |
| Diazepam 5 mg/2ml, Solupam | Dechra Veterinary Products, Torino, Italy | 105183014 (AIC) | Solution |
| Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | PNM-VIDEO-008 | Equipment |
| Digital video surveillance system of tethered EEG set up | EZVIZ Network, Hangzhou, Cina | EZVIZ (V5.3.2) | Equipment |
| Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity | Laboratoire Garcin-Bactinyl, France | LB 920111 | Solution |
| Dummy guide cannula 8 mm | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | CXD-8 | Material |
| Electrode 3-channel two-twisted | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA | MS333/3-B/SPC | Material |
| Electrode holder for stereotxic surgery | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | 1776-P1 | Equipment |
| Eppendorf BioSpectrometer basic | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6137 | Equipment |
Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL |
Eppendorf Srl, Milan, Italy | 30124332 | Material |
| Eppendorf μCuvette G1.0 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6138 | Equipment |
| Feeding needle flexible 17G for rat | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 7206 | Material |
| Grass Technology apparatus | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA | M665G08 | Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40) |
| Isoflurane 100%, IsoFlo | Zoetis, Rome, Italy | 103287025 (AIC) | Solution |
| Ketamine (Imalgene) | Merial, Toulouse, France | 221300288 (AIC) | Solution |
| Lithium chloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | L9650 | Material |
| Microinjection cannula 31G 9 mm | Agn Tho's, Lindigö Sweden | CXMI-9 | Material |
| MP150 modular data acquisition and analysis system | Biopac, Goleta, California, USA | MP150WSW | Equipment |
| Ophthalmic vet ointment, Hylo night | Ursapharm, Milan, Italy | 941791927 (AIC) | Material |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | P6503 | Material |
| PTFE Tube with joint | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | JT-10 | Material |
| Saline | 0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0 | Solution | |
| Scopolamine hydrobromide trihydrate | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S2250 | Material |
| Scopolamine methyl nitrate | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S1876 | Material |
| Silver sulfadiazine 1% cream | Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy | 025561010 (AIC) | Material |
| Simplex rapid dental methacrylic cement | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom | ACR811 | Material |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA | Model 963 | Equipment |
| Sucrose solution | 10% sucrose in distilled water | Home-made | Solution |
| Syringe 1 mL | Biosigma, Cona, Venezia, Italy | 20,71,26,03,00,350 | Material |
| Telemeters | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | CTA-F40 | Material |
| Telemetry EEG traces analyzer | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | NeuroScore v3-0 | Equipment |
| Telemetry system | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | Hardware plus software Ponemah core 6.51 | Equipment |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | X1251 | Material |
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