Bemonstering van hersenvocht en bloed uit laterale staartader bij ratten tijdens EEG-opnames
Summary
Het protocol toont herhaalde cerebrospinale vocht- en bloedafname van epileptische ratten die parallel worden uitgevoerd met continue video-elektro-encefalogram (EEG)-monitoring. Deze zijn van groot belang voor het onderzoeken van mogelijke verbanden tussen veranderingen in verschillende lichaamsvloeistofmoleculen en epileptische activiteit.
Abstract
Omdat de samenstelling van lichaamsvloeistoffen veel fysiologische en pathologische dynamieken weerspiegelt, worden biologische vloeistofmonsters vaak verkregen in veel experimentele contexten om interessante moleculen te meten, zoals hormonen, groeifactoren, eiwitten of kleine niet-coderende RNA’s. Een concreet voorbeeld is de bemonstering van biologische vloeistoffen in het onderzoek naar biomarkers voor epilepsie. In deze studies is het wenselijk om de niveaus van moleculen in cerebrospinale vloeistof (CSF) en in plasma te vergelijken, door CSF en plasma parallel te trekken en rekening te houden met de tijdsafstand van de bemonstering van en tot de aanvallen. De gecombineerde CSF- en plasmabemonstering, gekoppeld aan video-EEG-monitoring bij epileptische dieren, is een veelbelovende benadering voor de validatie van vermeende diagnostische en prognostische biomarkers. Hier wordt een procedure beschreven van gecombineerde CSF-terugtrekking uit cisterna magna en bloedafname uit de laterale staartader bij epileptische ratten die continu video-EEG worden gecontroleerd. Deze procedure biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van andere veelgebruikte technieken. Het maakt snelle bemonstering mogelijk met minimale pijn of invasiviteit en een kortere anesthesietijd. Bovendien kan het worden gebruikt om CSF- en plasmamonsters te verkrijgen in zowel vastgebonden als telemetrie EEG-geregistreerde ratten, en het kan herhaaldelijk worden gebruikt gedurende meerdere dagen van experiment. Door de stress als gevolg van bemonstering te minimaliseren door isofluraananesthesie te verkorten, wordt verwacht dat metingen de werkelijke niveaus van onderzochte moleculen in biovloeistoffen nauwkeuriger weergeven. Afhankelijk van de beschikbaarheid van een geschikte analytische test, kan deze techniek worden gebruikt om de niveaus van meerdere, verschillende moleculen te meten terwijl tegelijkertijd EEG-registratie wordt uitgevoerd.
Introduction
Cerebrospinale vloeistof (CSF) en bloedafname zijn belangrijk om biomarkers van epilepsie te identificeren en te valideren, zowel in preklinisch als klinisch onderzoek 1,2. Tegenwoordig richten de diagnose van epilepsie en het meeste onderzoek naar epilepsiebiomarkers zich op EEG en neuroimaging 3,4,5. Deze benaderingen brengen echter een aantal beperkingen met zich mee. Afgezien van routinematige hoofdhuidmetingen, vereist EEG in veel gevallen invasieve technieken zoals diepte-elektroden6. Beeldvormingsmethoden van de hersenen hebben een slechte temporele en ruimtelijke resolutie en zijn relatief duur en tijdrovend 7,8. Om deze reden zou de identificatie van niet-invasieve, goedkope en op biovloeistoffen gebaseerde biomarkers een zeer aantrekkelijk alternatief bieden. Bovendien kunnen deze biofluïde biomarkers worden gecombineerd met beschikbare diagnostische benaderingen om hun voorspellend vermogen aan te scherpen.
Patiënten met de diagnose epilepsie worden routinematig onderworpen aan EEG 9,10 en bloedafname 11,12,13,14, en velen ook aan CSF-ontwenning om levensbedreigende oorzaken (d.w.z. acute infecties, auto-immuunencefalitis) uit te sluiten15. Deze bloed- en CSF-monsters kunnen worden gebruikt in klinisch onderzoek dat gericht is op het identificeren van biomarkers voor epilepsie. Hogg en collega’s hebben bijvoorbeeld ontdekt dat een toename van drie plasma-tRNA-fragmenten voorafgaat aan het optreden van aanvallen bij menselijke epilepsie14. Evenzo kunnen interleukine-1bèta (IL-1β)-spiegels in menselijke CSF en serum, uitgedrukt als verhouding van IL-1β-niveaus in CSF ten opzichte van serum, de ontwikkeling van posttraumatische epilepsie na traumatisch hersenletsel voorspellen16. Deze studies benadrukken het belang van het bemonsteren van biovloeistoffen voor onderzoek naar epilepsiebiomarkers, maar ze worden geconfronteerd met meerdere beperkingen die inherent zijn aan klinische onderzoeken, bijvoorbeeld de medestichtende factor van anti-epileptica (AED’s) in bloed, het frequente gebrek aan etiologische informatie, ontoereikende controles, bescheiden aantallen patiënten en andere17,18.
Preklinisch onderzoek biedt andere mogelijkheden om moleculen in biovloeistoffen te onderzoeken als potentiële biomarkers voor epilepsie. Het is zelfs mogelijk om plasma en/of CSF van dieren af te nemen tijdens het uitvoeren van EEG-opnames. Bovendien kan de bemonstering herhaaldelijk worden uitgevoerd gedurende meerdere dagen van het experiment, en kunnen een aantal leeftijds-, geslachts- en epileptische beledigingscontroles worden gebruikt om de robuustheid van het onderzoek te verbeteren. Hier wordt een flexibele techniek beschreven om CSF te verkrijgen uit cisterna magna met parallelle terugtrekking van plasma uit de staartader bij EEG-gemonitorde ratten. De gepresenteerde techniek heeft verschillende voordelen ten opzichte van alternatieve methoden. Door gebruik te maken van een vlindernaaldbenadering is het mogelijk om CSF meerdere keren te verzamelen zonder de functie van EEG-elektroden of soortgelijke hoofdimplantaten in gevaar te brengen. Dit betekent een verfijning van de procedures voor het terugtrekken van intrathecale katheters, die gepaard gaan met een relatief hoog risico op infectie. Bovendien is de gerapporteerde vrije val-druppelbenadering die wordt gebruikt voor bloedafname superieur aan andere benaderingen van bloedafname in de staartader vanwege het sterk verminderde risico op hemolyse, vanwege het feit dat bloed niet door slangen gaat en er geen vacuümdruk wordt uitgeoefend. Als het onder strikte kiemvrije omstandigheden wordt uitgevoerd, is er een bijzonder laag risico op infectie voor dieren. Bovendien kan de bemonstering meerdere keren worden herhaald door de bloedafname helemaal aan het einde van de staart van de dieren te starten. Dergelijke technieken zijn gemakkelijk onder de knie te krijgen en kunnen worden toegepast in veel preklinische onderzoeken naar aandoeningen van het centrale zenuwstelsel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het huidige werk illustreert een gemakkelijk te beheersen techniek van CSF en bloedafname bij ratten, die niet alleen nuttig kan zijn voor studies in modellen van epilepsie, maar ook van andere neurologische aandoeningen of ziekten zoals Alzheimer, Parkinson of multiple sclerose. In epilepsieonderzoek zijn beide bemonsteringsprocedures in combinatie met video-EEG ideaal wanneer een correlatie tussen de niveaus van verschillende oplosbare moleculen en aanvalsactiviteit wordt nagestreefd. Om deze specifieke reden werd een …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door een subsidie van het Horizon 2020-werkprogramma van de Europese Unie (oproep H2020-FETOPEN-2018-2020) in het kader van subsidieovereenkomst 964712 (PRIME; aan M. Simonato).
Materials
| Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok | BD Italy SpA, Milan, Italy | 367246 | Material |
| Blood Collection tubes (Microtainer K2E) | BD Italy SpA, Milan, Italy | 365975 | Material |
| Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm | Nipro, Osaka, Japan | PSY-23-ET-ICU | Material |
| Centrifuge refrigerated ALC PK 130R | DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England | 112000033 | Material |
| Cotton suture 3-0 | Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA | 7343H | Material |
| Diazepam 5 mg/2ml, Solupam | Dechra Veterinary Products, Torino, Italy | 105183014 (AIC) | Solution |
| Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | PNM-VIDEO-008 | Equipment |
| Digital video surveillance system of tethered EEG set up | EZVIZ Network, Hangzhou, Cina | EZVIZ (V5.3.2) | Equipment |
| Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity | Laboratoire Garcin-Bactinyl, France | LB 920111 | Solution |
| Dummy guide cannula 8 mm | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | CXD-8 | Material |
| Electrode 3-channel two-twisted | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA | MS333/3-B/SPC | Material |
| Electrode holder for stereotxic surgery | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | 1776-P1 | Equipment |
| Eppendorf BioSpectrometer basic | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6137 | Equipment |
Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL |
Eppendorf Srl, Milan, Italy | 30124332 | Material |
| Eppendorf μCuvette G1.0 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6138 | Equipment |
| Feeding needle flexible 17G for rat | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 7206 | Material |
| Grass Technology apparatus | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA | M665G08 | Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40) |
| Isoflurane 100%, IsoFlo | Zoetis, Rome, Italy | 103287025 (AIC) | Solution |
| Ketamine (Imalgene) | Merial, Toulouse, France | 221300288 (AIC) | Solution |
| Lithium chloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | L9650 | Material |
| Microinjection cannula 31G 9 mm | Agn Tho's, Lindigö Sweden | CXMI-9 | Material |
| MP150 modular data acquisition and analysis system | Biopac, Goleta, California, USA | MP150WSW | Equipment |
| Ophthalmic vet ointment, Hylo night | Ursapharm, Milan, Italy | 941791927 (AIC) | Material |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | P6503 | Material |
| PTFE Tube with joint | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | JT-10 | Material |
| Saline | 0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0 | Solution | |
| Scopolamine hydrobromide trihydrate | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S2250 | Material |
| Scopolamine methyl nitrate | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S1876 | Material |
| Silver sulfadiazine 1% cream | Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy | 025561010 (AIC) | Material |
| Simplex rapid dental methacrylic cement | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom | ACR811 | Material |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA | Model 963 | Equipment |
| Sucrose solution | 10% sucrose in distilled water | Home-made | Solution |
| Syringe 1 mL | Biosigma, Cona, Venezia, Italy | 20,71,26,03,00,350 | Material |
| Telemeters | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | CTA-F40 | Material |
| Telemetry EEG traces analyzer | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | NeuroScore v3-0 | Equipment |
| Telemetry system | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | Hardware plus software Ponemah core 6.51 | Equipment |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | X1251 | Material |
References
- Hanin, A., et al. Cerebrospinal fluid and blood biomarkers of status epilepticus. Epilepsia. 61 (1), 6-18 (2020).
- Pitkänen, A., et al. Advances in the development of biomarkers for epilepsy. The Lancet Neurology. 15 (8), 843-856 (2016).
- Dlugos, D., et al. Childhood Absence Epilepsy Study Team (2013). Pretreatment EEG in childhood absence epilepsy: associations with attention and treatment outcome. Neurology. 81 (2), 150-156 (2013).
- Lorenzo, N. Y., et al. Intractable frontal lobe epilepsy: pathological and MRI features. Epilepsy research. 20 (2), 171-178 (1995).
- van Dellen, E., et al. Epilepsy surgery outcome and functional network alterations in longitudinal MEG: a minimum spanning tree analysis. NeuroImage. 86, 354-363 (2014).
- Shah, A. K., Mittal, S. Invasive electroencephalography monitoring: Indications and presurgical planning. Annals of Indian Academy of Neurology. 17 (Suppl 1), S89-S94 (2014).
- Whiting, P., et al. A systematic review of the effectiveness and cost-effectiveness of neuroimaging assessments used to visualise the seizure focus in people with refractory epilepsy being considered for surgery. Health technology assessment. 10 (4), 1-iv (2006).
- Lenkov, D. N., Volnova, A. B., Pope, A. R., Tsytsarev, V. Advantages and limitations of brain imaging methods in the research of absence epilepsy in humans and animal models. Journal of neuroscience methods. 212 (2), 195-202 (2013).
- Leach, J. P., Stephen, L. J., Salveta, C., Brodie, M. J. Which electroencephalography (EEG) for epilepsy? The relative usefulness of different EEG protocols in patients with possible epilepsy. Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry. 77 (9), 1040-1042 (2006).
- Huppertz, H. J., et al. Localization of interictal delta and epileptiform EEG activity associated with focal epileptogenic brain lesions. NeuroImage. 13 (1), 15-28 (2001).
- Linder, C., et al. Comparison between dried blood spot and plasma sampling for therapeutic drug monitoring of antiepileptic drugs in children with epilepsy: A step towards home sampling. Clinical biochemistry. 50 (7-8), 418-424 (2017).
- Wegner, I., Wilhelm, A. J., Lambrechts, D. A., Sander, J. W., Lindhout, D. Effect of oral contraceptives on lamotrigine levels depends on comedication. Acta neurologica Scandinavica. 129 (6), 393-398 (2014).
- Palmio, J., et al. CSF and plasma adipokines after tonic-clonic seizures. Seizure. 39, 10-12 (2016).
- Hogg, M. C., et al. Elevation in plasma tRNA fragments precede seizures in human epilepsy. Journal of Clinical Investigation. 129 (7), 2946-2951 (2019).
- Ellul, M., Solomon, T. Acute encephalitis – diagnosis and management. Clinical medicine. 18 (2), 155-159 (2018).
- Diamond, M. L., et al. IL-1β associations with posttraumatic epilepsy development: a genetics and biomarker cohort study. Epilepsia. 55 (7), 1109-1119 (2014).
- Auvin, S., et al. Prospective clinical trials to investigate clinical and molecular biomarkers. Epilepsia. 58 (Suppl 3), 20-26 (2017).
- Weber, Y. G., Nies, A. T., Schwab, M., Lerche, H. Genetic biomarkers in epilepsy. Neurotherapeutics. 11 (2), 324-333 (2014).
- Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. Journal of Visualized Experiments. (59), e3528 (2012).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880 (2008).
- Gardiner, T. W., Toth, L. A. Stereotactic Surgery and Long-Term Maintenance of Cranial Implants in Research Animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 38 (1), 56-63 (1999).
- Westergren, I., Johansson, B. B. Changes in physiological parameters of rat cerebrospinal fluid during chronic sampling: evaluation of two sampling methods. Brain Research Bulletin. 27 (2), 283-286 (1991).
- Soukupová, M., et al. Impairment of GABA release in the hippocampus at the time of the first spontaneous seizure in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Experimental Neurology. 257, 39-49 (2014).
- Soukupová, M., et al. Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58455 (2018).
- Guarino, A., et al. Low-dose 7,8-Dihydroxyflavone Administration After Status Epilepticus Prevents Epilepsy Development. Neurotherapeutics. 19 (6), 1951-1965 (2022).
- Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S. G., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
- Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation: II. Motor seizure. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 32 (3), 281-294 (1972).
- Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
- . Blood sampling: Rat Available from: https://nc3rs.org.uk/3rs-resources/blood-sampling/blood-sampling-rat (2022)
- Powles-Glover, N., Kirk, S., Wilkinson, C., Robinson, S., Stewart, J. Assessment of toxicological effects of blood microsampling in the vehicle dosed adult rat. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 68 (3), 325-331 (2014).
- Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animal. 32 (4), 369-376 (1998).
- Wang, D., Zhao, Y., Yang, Y., Xie, H. Safety assessment of multiple repeated percutaneous punctures for the collection of cerebrospinal fluid in rats. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 54 (6), e10032 (2021).
- Möller, C., et al. Impact of repeated kindled seizures on heart rate rhythms, heart rate variability, and locomotor activity in rats. Epilepsy & Behavior. 92, 36-44 (2019).
- Espinosa-Garcia, C., Zeleke, H., Rojas, A. Impact of Stress on Epilepsy: Focus on Neuroinflammation-A Mini Review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 4061 (2021).
- Cassar, S. C., et al. Comparing levels of biochemical markers in CSF from cannulated and non-cannulated rats. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 249-253 (2010).
- Huang, Y. L., Säljö, A., Suneson, A., Hansson, H. A. Comparison among different approaches for sampling cerebrospinal fluid in rats. Brain Research Bulletin. 41 (5), 273-279 (1996).
- Hattori, N., Takumi, A., Saito, K., Saito, Y. Effects of serial cervical or tail blood sampling on toxicity and toxicokinetic evaluation in rats. Journal of Toxicological Sciences. 45 (10), 599-609 (2020).
- Roncon, P., et al. MicroRNA profiles in hippocampal granule cells and plasma of rats with pilocarpine-induced epilepsy–comparison with human epileptic samples. Scientific Reports. 5, 14143 (2015).
- van Vliet, E. A., et al. Standardization procedure for plasma biomarker analysis in rat models of epileptogenesis: Focus on circulating microRNAs. Epilepsia. 58 (12), 2013-2024 (2017).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6 (9), e24145 (2011).
- Grimm, H., et al. Advancing the 3Rs: innovation, implementation, ethics and society. Frontiers in Veterinary Science. 10, 1185706 (2023).
