أخذ عينات من السائل الدماغي الشوكي والدم من الوريد الذيل الجانبي في الفئران أثناء تسجيلات EEG
Summary
يظهر البروتوكول عمليات جمع متكررة للسائل النخاعي والدم من الفئران المصابة بالصرع بالتوازي مع المراقبة المستمرة لتخطيط كهربية الدماغ بالفيديو (EEG). هذه مفيدة لاستكشاف الروابط المحتملة بين التغيرات في جزيئات سوائل الجسم المختلفة ونشاط النوبات.
Abstract
نظرا لأن تكوين سوائل الجسم يعكس العديد من الديناميات الفسيولوجية والمرضية ، يتم الحصول على عينات السائل البيولوجي بشكل شائع في العديد من السياقات التجريبية لقياس الجزيئات ذات الأهمية ، مثل الهرمونات أو عوامل النمو أو البروتينات أو الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر. مثال محدد هو أخذ عينات من السوائل البيولوجية في البحث عن المؤشرات الحيوية للصرع. في هذه الدراسات ، من المستحسن مقارنة مستويات الجزيئات في السائل النخاعي (CSF) وفي البلازما ، عن طريق سحب السائل الدماغي الشوكي والبلازما بالتوازي والنظر في المسافة الزمنية لأخذ العينات من وإلى النوبات. يعد الجمع بين CSF وأخذ عينات البلازما ، إلى جانب مراقبة تخطيط كهربية الدماغ بالفيديو في المصابة بالصرع ، نهجا واعدا للتحقق من صحة المؤشرات الحيوية التشخيصية والتنبؤية المفترضة. هنا ، يتم وصف إجراء انسحاب السائل الدماغي الشوكي المشترك من الصهريج العظيم وأخذ عينات الدم من الوريد الجانبي للذيل في الفئران المصابة بالصرع والتي يتم مراقبتها باستمرار بواسطة تخطيط كهربية الدماغ بالفيديو. يوفر هذا الإجراء مزايا كبيرة مقارنة بالتقنيات الأخرى شائعة الاستخدام. يسمح بأخذ العينات بسرعة مع الحد الأدنى من الألم أو الغزو ، وتقليل وقت التخدير. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدامه للحصول على عينات CSF والبلازما في كل من الفئران المسجلة EEG المربوطة والقياس عن بعد ، ويمكن استخدامه بشكل متكرر عبر أيام متعددة من التجربة. من خلال تقليل الإجهاد الناتج عن أخذ العينات عن طريق تقصير تخدير الأيزوفلوران ، من المتوقع أن تعكس التدابير بشكل أكثر دقة المستويات الحقيقية للجزيئات التي تم فحصها في السوائل الحيوية. اعتمادا على توافر مقايسة تحليلية مناسبة ، يمكن استخدام هذه التقنية لقياس مستويات جزيئات متعددة ومختلفة أثناء إجراء تسجيل EEG في نفس الوقت.
Introduction
يعد السائل الدماغي الشوكي (CSF) وأخذ عينات الدم مهمين لتحديد المؤشرات الحيوية للصرع والتحقق من صحتها ، في كل من الأبحاث قبل السريرية والسريرية 1,2. في الوقت الحاضر ، يركز تشخيص الصرع ومعظم الأبحاث حول المؤشرات الحيوية للصرع على EEG والتصوير العصبي3،4،5. غير أن هذه النهج تنطوي على العديد من القيود. بصرف النظر عن قياسات فروة الرأس الروتينية ، في كثير من الحالات ، يتطلب تخطيط كهربية الدماغ تقنيات غازية مثل أقطاب العمق6. تتميز طرق تصوير الدماغ بضعف الدقة الزمنية والمكانية وهي مكلفة نسبيا وتستغرقوقتا طويلا 7,8. ولهذا السبب، فإن تحديد المؤشرات الحيوية غير الغازية والمنخفضة التكلفة والقائمة على السوائل الحيوية من شأنه أن يوفر بديلا جذابا للغاية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن دمج هذه المؤشرات الحيوية للسوائل الحيوية مع مناهج التشخيص المتاحة لشحذ قدرتها على التنبؤ.
يتم تقديم المرضى الذين تم تشخيص إصابتهم بالصرع بشكل روتيني إلى EEG 9,10 وأخذ عينات الدم11,12,13,14 ، والعديد منهم أيضا إلى انسحاب السائل الدماغي النخاعي لاستبعاد الأسباب التي تهدد الحياة (مثل الالتهابات الحادة والتهاب الدماغ المناعي الذاتي)15. يمكن استخدام عينات الدم والسائل الدماغي الشوكي هذه في الأبحاث السريرية التي تهدف إلى تحديد المؤشرات الحيوية للصرع. على سبيل المثال ، وجد هوغ وزملاؤه في العمل أن الزيادة في ثلاث شظايا من الحمض النووي الريبي البلازمي تسبق حدوث النوبات في الصرع البشري14. وبالمثل ، يمكن لمستويات إنترلوكين -1بيتا (IL-1β) في السائل الدماغي النخاعي البشري والمصل ، معبرا عنها كنسبة من مستويات IL-1β في السائل الدماغي النخاعي على المصل ، أن تتنبأ بتطور الصرع بعد الصدمة بعد إصابة الدماغالرضحية 16. تسلط هذه الدراسات الضوء على أهمية أخذ عينات السوائل الحيوية لأبحاث المؤشرات الحيوية للصرع ، لكنها تواجه قيودا متعددة جوهرية للتجارب السريرية ، على سبيل المثال ، العامل التأسيسي للأدوية المضادة للصرع (AEDs) في الدم ، والنقص المتكرر في معلومات المسببات ، وعدم كفاية الضوابط ، وأعداد متواضعة من المرضى ، وغيرهم17،18.
توفر الأبحاث قبل السريرية فرصا أخرى للتحقيق في الجزيئات في السوائل الحيوية كمؤشرات حيوية محتملة للصرع. في الواقع ، من الممكن سحب البلازما و / أو السائل الدماغي الشوكي من أثناء إجراء تسجيلات EEG. علاوة على ذلك ، يمكن إجراء أخذ العينات بشكل متكرر عبر أيام متعددة من التجربة ، ويمكن استخدام عدد من عناصر التحكم المتطابقة مع العمر والجنس والصرع لتحسين قوة الدراسة. هنا ، يتم وصف تقنية مرنة للحصول على السائل الدماغي الشوكي من cisterna magna مع الانسحاب المتوازي للبلازما من الوريد الذيلي في الفئران التي يراقبها EEG بالتفصيل. التقنية المقدمة لها العديد من المزايا على الطرق البديلة. باستخدام نهج إبرة الفراشة ، من الممكن جمع السائل الدماغي النخاعي عدة مرات دون المساس بوظيفة أقطاب EEG أو غرسات الرأس المماثلة. وهذا يمثل صقلا لإجراءات سحب القسطرة داخل القراب ، والتي ترتبط بخطر مرتفع نسبيا للإصابة بالعدوى. بالإضافة إلى ذلك ، فإن نهج إسقاط السقوط الحر المبلغ عنه المستخدم لجمع الدم يتفوق على الأساليب الأخرى لسحب الدم في الوريد الذيل بسبب انخفاض خطر انحلال الدم بشكل كبير ، نظرا لحقيقة أن الدم لا يمر عبر الأنابيب ولا يتم تطبيق ضغط فراغ. إذا تم إجراؤها في ظل ظروف صارمة خالية من الجراثيم ، فهناك خطر منخفض بشكل خاص للإصابة بالحيوانات. بالإضافة إلى ذلك ، من خلال بدء سحب الدم في نهاية ذيول ، يمكن تكرار أخذ العينات عدة مرات. من السهل إتقان هذه التقنيات ويمكن تطبيقها في العديد من الدراسات قبل السريرية لاضطرابات الجهاز العصبي المركزي.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوضح هذا العمل تقنية سهلة الإتقان ل CSF وجمع الدم في الفئران ، والتي قد تكون مفيدة ليس فقط للدراسات في نماذج الصرع ولكن أيضا للحالات أو الأمراض العصبية الأخرى مثل مرض الزهايمر أو باركنسون أو التصلب المتعدد. في أبحاث الصرع ، تعتبر كل من إجراءات أخذ العينات إلى جانب تخطيط كهربية الدماغ بالفيد?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة بمنحة من برنامج عمل أفق 2020 التابع للاتحاد الأوروبي (اتصل ب H2020-FETOPEN-2018-2020) بموجب اتفاقية المنحة 964712 (PRIME ؛ إلى M. Simonato).
Materials
| Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok | BD Italy SpA, Milan, Italy | 367246 | Material |
| Blood Collection tubes (Microtainer K2E) | BD Italy SpA, Milan, Italy | 365975 | Material |
| Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm | Nipro, Osaka, Japan | PSY-23-ET-ICU | Material |
| Centrifuge refrigerated ALC PK 130R | DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England | 112000033 | Material |
| Cotton suture 3-0 | Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA | 7343H | Material |
| Diazepam 5 mg/2ml, Solupam | Dechra Veterinary Products, Torino, Italy | 105183014 (AIC) | Solution |
| Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | PNM-VIDEO-008 | Equipment |
| Digital video surveillance system of tethered EEG set up | EZVIZ Network, Hangzhou, Cina | EZVIZ (V5.3.2) | Equipment |
| Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity | Laboratoire Garcin-Bactinyl, France | LB 920111 | Solution |
| Dummy guide cannula 8 mm | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | CXD-8 | Material |
| Electrode 3-channel two-twisted | Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA | MS333/3-B/SPC | Material |
| Electrode holder for stereotxic surgery | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | 1776-P1 | Equipment |
| Eppendorf BioSpectrometer basic | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6137 | Equipment |
Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL |
Eppendorf Srl, Milan, Italy | 30124332 | Material |
| Eppendorf μCuvette G1.0 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 6138 | Equipment |
| Feeding needle flexible 17G for rat | Agn Tho's, Lindigö Sweden | 7206 | Material |
| Grass Technology apparatus | Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA | M665G08 | Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40) |
| Isoflurane 100%, IsoFlo | Zoetis, Rome, Italy | 103287025 (AIC) | Solution |
| Ketamine (Imalgene) | Merial, Toulouse, France | 221300288 (AIC) | Solution |
| Lithium chloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | L9650 | Material |
| Microinjection cannula 31G 9 mm | Agn Tho's, Lindigö Sweden | CXMI-9 | Material |
| MP150 modular data acquisition and analysis system | Biopac, Goleta, California, USA | MP150WSW | Equipment |
| Ophthalmic vet ointment, Hylo night | Ursapharm, Milan, Italy | 941791927 (AIC) | Material |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | P6503 | Material |
| PTFE Tube with joint | Agn Tho's, Lindigö, Sweden | JT-10 | Material |
| Saline | 0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0 | Solution | |
| Scopolamine hydrobromide trihydrate | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S2250 | Material |
| Scopolamine methyl nitrate | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | S1876 | Material |
| Silver sulfadiazine 1% cream | Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy | 025561010 (AIC) | Material |
| Simplex rapid dental methacrylic cement | Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom | ACR811 | Material |
| Stereotaxic apparatus | David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA | Model 963 | Equipment |
| Sucrose solution | 10% sucrose in distilled water | Home-made | Solution |
| Syringe 1 mL | Biosigma, Cona, Venezia, Italy | 20,71,26,03,00,350 | Material |
| Telemeters | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | CTA-F40 | Material |
| Telemetry EEG traces analyzer | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | NeuroScore v3-0 | Equipment |
| Telemetry system | Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA | Hardware plus software Ponemah core 6.51 | Equipment |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Milan, Italy | X1251 | Material |
References
- Hanin, A., et al. Cerebrospinal fluid and blood biomarkers of status epilepticus. Epilepsia. 61 (1), 6-18 (2020).
- Pitkänen, A., et al. Advances in the development of biomarkers for epilepsy. The Lancet Neurology. 15 (8), 843-856 (2016).
- Dlugos, D., et al. Childhood Absence Epilepsy Study Team (2013). Pretreatment EEG in childhood absence epilepsy: associations with attention and treatment outcome. Neurology. 81 (2), 150-156 (2013).
- Lorenzo, N. Y., et al. Intractable frontal lobe epilepsy: pathological and MRI features. Epilepsy research. 20 (2), 171-178 (1995).
- van Dellen, E., et al. Epilepsy surgery outcome and functional network alterations in longitudinal MEG: a minimum spanning tree analysis. NeuroImage. 86, 354-363 (2014).
- Shah, A. K., Mittal, S. Invasive electroencephalography monitoring: Indications and presurgical planning. Annals of Indian Academy of Neurology. 17 (Suppl 1), S89-S94 (2014).
- Whiting, P., et al. A systematic review of the effectiveness and cost-effectiveness of neuroimaging assessments used to visualise the seizure focus in people with refractory epilepsy being considered for surgery. Health technology assessment. 10 (4), 1-iv (2006).
- Lenkov, D. N., Volnova, A. B., Pope, A. R., Tsytsarev, V. Advantages and limitations of brain imaging methods in the research of absence epilepsy in humans and animal models. Journal of neuroscience methods. 212 (2), 195-202 (2013).
- Leach, J. P., Stephen, L. J., Salveta, C., Brodie, M. J. Which electroencephalography (EEG) for epilepsy? The relative usefulness of different EEG protocols in patients with possible epilepsy. Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry. 77 (9), 1040-1042 (2006).
- Huppertz, H. J., et al. Localization of interictal delta and epileptiform EEG activity associated with focal epileptogenic brain lesions. NeuroImage. 13 (1), 15-28 (2001).
- Linder, C., et al. Comparison between dried blood spot and plasma sampling for therapeutic drug monitoring of antiepileptic drugs in children with epilepsy: A step towards home sampling. Clinical biochemistry. 50 (7-8), 418-424 (2017).
- Wegner, I., Wilhelm, A. J., Lambrechts, D. A., Sander, J. W., Lindhout, D. Effect of oral contraceptives on lamotrigine levels depends on comedication. Acta neurologica Scandinavica. 129 (6), 393-398 (2014).
- Palmio, J., et al. CSF and plasma adipokines after tonic-clonic seizures. Seizure. 39, 10-12 (2016).
- Hogg, M. C., et al. Elevation in plasma tRNA fragments precede seizures in human epilepsy. Journal of Clinical Investigation. 129 (7), 2946-2951 (2019).
- Ellul, M., Solomon, T. Acute encephalitis – diagnosis and management. Clinical medicine. 18 (2), 155-159 (2018).
- Diamond, M. L., et al. IL-1β associations with posttraumatic epilepsy development: a genetics and biomarker cohort study. Epilepsia. 55 (7), 1109-1119 (2014).
- Auvin, S., et al. Prospective clinical trials to investigate clinical and molecular biomarkers. Epilepsia. 58 (Suppl 3), 20-26 (2017).
- Weber, Y. G., Nies, A. T., Schwab, M., Lerche, H. Genetic biomarkers in epilepsy. Neurotherapeutics. 11 (2), 324-333 (2014).
- Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. Journal of Visualized Experiments. (59), e3528 (2012).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880 (2008).
- Gardiner, T. W., Toth, L. A. Stereotactic Surgery and Long-Term Maintenance of Cranial Implants in Research Animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 38 (1), 56-63 (1999).
- Westergren, I., Johansson, B. B. Changes in physiological parameters of rat cerebrospinal fluid during chronic sampling: evaluation of two sampling methods. Brain Research Bulletin. 27 (2), 283-286 (1991).
- Soukupová, M., et al. Impairment of GABA release in the hippocampus at the time of the first spontaneous seizure in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Experimental Neurology. 257, 39-49 (2014).
- Soukupová, M., et al. Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58455 (2018).
- Guarino, A., et al. Low-dose 7,8-Dihydroxyflavone Administration After Status Epilepticus Prevents Epilepsy Development. Neurotherapeutics. 19 (6), 1951-1965 (2022).
- Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S. G., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
- Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation: II. Motor seizure. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 32 (3), 281-294 (1972).
- Zou, W., et al. Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
- . Blood sampling: Rat Available from: https://nc3rs.org.uk/3rs-resources/blood-sampling/blood-sampling-rat (2022)
- Powles-Glover, N., Kirk, S., Wilkinson, C., Robinson, S., Stewart, J. Assessment of toxicological effects of blood microsampling in the vehicle dosed adult rat. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 68 (3), 325-331 (2014).
- Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animal. 32 (4), 369-376 (1998).
- Wang, D., Zhao, Y., Yang, Y., Xie, H. Safety assessment of multiple repeated percutaneous punctures for the collection of cerebrospinal fluid in rats. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 54 (6), e10032 (2021).
- Möller, C., et al. Impact of repeated kindled seizures on heart rate rhythms, heart rate variability, and locomotor activity in rats. Epilepsy & Behavior. 92, 36-44 (2019).
- Espinosa-Garcia, C., Zeleke, H., Rojas, A. Impact of Stress on Epilepsy: Focus on Neuroinflammation-A Mini Review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 4061 (2021).
- Cassar, S. C., et al. Comparing levels of biochemical markers in CSF from cannulated and non-cannulated rats. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 249-253 (2010).
- Huang, Y. L., Säljö, A., Suneson, A., Hansson, H. A. Comparison among different approaches for sampling cerebrospinal fluid in rats. Brain Research Bulletin. 41 (5), 273-279 (1996).
- Hattori, N., Takumi, A., Saito, K., Saito, Y. Effects of serial cervical or tail blood sampling on toxicity and toxicokinetic evaluation in rats. Journal of Toxicological Sciences. 45 (10), 599-609 (2020).
- Roncon, P., et al. MicroRNA profiles in hippocampal granule cells and plasma of rats with pilocarpine-induced epilepsy–comparison with human epileptic samples. Scientific Reports. 5, 14143 (2015).
- van Vliet, E. A., et al. Standardization procedure for plasma biomarker analysis in rat models of epileptogenesis: Focus on circulating microRNAs. Epilepsia. 58 (12), 2013-2024 (2017).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6 (9), e24145 (2011).
- Grimm, H., et al. Advancing the 3Rs: innovation, implementation, ethics and society. Frontiers in Veterinary Science. 10, 1185706 (2023).
