Summary

Entnahme von Liquor und Blut aus der seitlichen Schwanzvene bei Ratten während EEG-Aufzeichnungen

Published: September 01, 2023
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Summary

Das Protokoll zeigt wiederholte Liquor- und Blutentnahmen von epileptischen Ratten, die parallel zur kontinuierlichen Video-Elektroenzephalogramm-Überwachung (EEG) durchgeführt werden. Diese sind von entscheidender Bedeutung, um mögliche Zusammenhänge zwischen Veränderungen verschiedener Körperflüssigkeitsmoleküle und der Anfallsaktivität zu untersuchen.

Abstract

Da die Zusammensetzung von Körperflüssigkeiten viele physiologische und pathologische Dynamiken widerspiegelt, werden in vielen experimentellen Kontexten üblicherweise biologische Flüssigkeitsproben gewonnen, um Moleküle von Interesse wie Hormone, Wachstumsfaktoren, Proteine oder kleine nicht-kodierende RNAs zu messen. Ein konkretes Beispiel ist die Probenahme biologischer Flüssigkeiten bei der Erforschung von Biomarkern für Epilepsie. In diesen Studien ist es wünschenswert, die Konzentrationen von Molekülen in der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) und im Plasma zu vergleichen, indem Liquor und Plasma parallel entnommen werden und der zeitliche Abstand der Probenahme von und zu den Anfällen berücksichtigt wird. Die kombinierte Liquor- und Plasmaprobenahme, gekoppelt mit Video-EEG-Monitoring bei epileptischen Tieren, ist ein vielversprechender Ansatz für die Validierung von putativen diagnostischen und prognostischen Biomarkern. Hier wird ein Verfahren der kombinierten Liquorentnahme aus der Cisterna magna und der Blutentnahme aus der lateralen Schwanzvene bei epileptischen Ratten beschrieben, die kontinuierlich per Video-EEG überwacht werden. Dieses Verfahren bietet erhebliche Vorteile gegenüber anderen häufig verwendeten Techniken. Es ermöglicht eine schnelle Probenentnahme mit minimalen Schmerzen oder Invasivität und verkürzter Anästhesiezeit. Darüber hinaus kann es verwendet werden, um Liquor- und Plasmaproben sowohl bei angebundenen als auch bei telemetrischen EEG-aufgezeichneten Ratten zu erhalten, und es kann wiederholt über mehrere Experimenttage hinweg verwendet werden. Durch die Minimierung des Stresses durch die Probenahme durch Verkürzung der Isofluran-Anästhesie sollen die Messungen die wahren Konzentrationen der untersuchten Moleküle in Bioflüssigkeiten genauer widerspiegeln. Abhängig von der Verfügbarkeit eines geeigneten analytischen Assays kann diese Technik verwendet werden, um die Konzentrationen mehrerer verschiedener Moleküle zu messen und gleichzeitig eine EEG-Aufzeichnung durchzuführen.

Introduction

Liquor cerebrospinalis (CSF) und Blutproben sind wichtig, um Biomarker für Epilepsie zu identifizieren und zu validieren, sowohl in der präklinischen als auch in der klinischen Forschung 1,2. Heutzutage konzentrieren sich die Diagnose der Epilepsie und die meisten Forschungen zu Epilepsie-Biomarkern auf EEG und Neuroimaging 3,4,5. Diese Ansätze weisen jedoch einige Einschränkungen auf. Abgesehen von routinemäßigen Kopfhautmessungen erfordert das EEG in vielen Fällen invasive Techniken wie Tiefenelektroden6. Bildgebende Verfahren des Gehirns haben eine schlechte zeitliche und räumliche Auflösung und sind relativ teuer und zeitaufwändig 7,8. Aus diesem Grund wäre die Identifizierung von nicht-invasiven, kostengünstigen und biofluidbasierten Biomarkern eine sehr attraktive Alternative. Darüber hinaus könnten diese Biofluid-Biomarker mit verfügbaren diagnostischen Ansätzen kombiniert werden, um ihre Vorhersagefähigkeit zu schärfen.

Patienten, bei denen Epilepsie diagnostiziert wurde, werden routinemäßig einem EEG 9,10 und einer Blutentnahme 11,12,13,14 unterzogen, und viele auch einer Liquorentnahme, um lebensbedrohliche Ursachen (z. B. akute Infektionen, autoimmune Enzephalitis) auszuschließen15. Diese Blut- und Liquorproben können in der klinischen Forschung verwendet werden, um Biomarker für Epilepsie zu identifizieren. Zum Beispiel haben Hogg und Mitarbeiter herausgefunden, dass ein Anstieg von drei Plasma-tRNA-Fragmenten dem Auftreten von Anfällen bei menschlicher Epilepsie vorausgeht14. In ähnlicher Weise können Interleukin-1beta (IL-1β)-Spiegel im menschlichen Liquor und Serum, ausgedrückt als Verhältnis der IL-1β-Spiegel im Liquor zum Serum, die Entwicklung einer posttraumatischen Epilepsie nach einem Schädel-Hirn-Trauma vorhersagen16. Diese Studien unterstreichen die Bedeutung der Probenahme von Bioflüssigkeiten für die Epilepsie-Biomarker-Forschung, aber sie sehen sich mit mehreren Einschränkungen konfrontiert, die klinischen Studien innewohnen, z. B. der Mitbegründungsfaktor von Antiepileptika (AEDs) im Blut, der häufige Mangel an Informationen über die Ätiologie, unzureichende Kontrollen, eine bescheidene Anzahl von Patienten und andere17,18.

Die präklinische Forschung bietet weitere Möglichkeiten, Moleküle in Bioflüssigkeiten als potenzielle Biomarker für Epilepsie zu untersuchen. Tatsächlich ist es möglich, Plasma und/oder Liquor von Tieren zu entnehmen, während EEG-Aufzeichnungen durchgeführt werden. Darüber hinaus kann die Probenahme wiederholt über mehrere Tage des Experiments durchgeführt werden, und eine Reihe von Kontrollen, die mit Alter, Geschlecht und epileptischen Beleidigungen übereinstimmen, können verwendet werden, um die Robustheit der Studie zu verbessern. Hier wird eine flexible Technik zur Gewinnung von Liquor aus Cisterna magna mit paralleler Entnahme von Plasma aus der Schwanzvene bei EEG-überwachten Ratten detailliert beschrieben. Die vorgestellte Technik hat mehrere Vorteile gegenüber alternativen Methoden. Durch die Verwendung eines Schmetterlingsnadelansatzes ist es möglich, Liquor mehrmals zu entnehmen, ohne die Funktion von EEG-Elektroden oder ähnlichen Kopfimplantaten zu beeinträchtigen. Dies stellt eine Verfeinerung der intrathekalen Katheterentnahmeverfahren dar, die mit einem relativ hohen Infektionsrisiko verbunden sind. Darüber hinaus ist der für die Blutentnahme verwendete Freifall-Tropfen-Ansatz anderen Ansätzen der Schwanzvenen-Blutentnahme überlegen, da das Risiko einer Hämolyse stark reduziert ist, da das Blut nicht durch Schläuche fließt und kein Vakuumdruck ausgeübt wird. Unter streng keimfreien Bedingungen durchgeführt, besteht für die Tiere ein besonders geringes Infektionsrisiko. Darüber hinaus kann durch den Beginn der Blutentnahme ganz am Ende des Schwanzes der Tiere die Entnahme mehrmals wiederholt werden. Solche Techniken sind leicht zu beherrschen und können in vielen präklinischen Studien zu Erkrankungen des zentralen Nervensystems angewendet werden.

Protocol

Alle Versuchsverfahren wurden vom Ausschuss für institutionelle Tierpflege und -verwendung der Universität Ferrara und vom italienischen Gesundheitsministerium (Zulassung: D.M. 603/2022-PR) gemäß den Richtlinien der Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaften vom 24. November 1986 (86/609/EWG) zum Schutz von Tieren, die für Versuche und andere wissenschaftliche Zwecke verwendet werden, genehmigt. Dieses Protokoll ist speziell für weitere quantitative Polymerase-Kettenreaktionsanalysen (qPCR) von kleinen n…

Representative Results

Das Ergebnis verschiedener Liquor- und Blutentnahmeverfahren, die bei 9 Kontroll- und 18 chronisch epileptischen Ratten durchgeführt wurden, die alle 1 Monat nach der SE mit Elektroden implantiert wurden, wird in Bezug auf die Erfolgsrate berichtet. Nach der Implantation wurden alle Ratten 1 Monat lang mit einem Video-EEG überwacht, wobei der Liquor plus Blut in den beiden letzten Wochen des Experiments (d.h. an den Tagen 52, 55, 58, 61 und 64 nach SE; dpSE) 5x alle 3 Tage entnommen wurde. Daten von mehreren Entnahmen …

Discussion

Die vorliegende Arbeit veranschaulicht eine leicht zu beherrschende Technik der Liquor- und Blutentnahme bei Ratten, die nicht nur für Studien in Modellen der Epilepsie, sondern auch für andere neurologische Zustände oder Krankheiten wie Alzheimer, Parkinson oder Multiple Sklerose nützlich sein kann. In der Epilepsieforschung sind beide Probenahmeverfahren gekoppelt mit Video-EEG ideal, wenn eine Korrelation zwischen den Konzentrationen verschiedener löslicher Moleküle und der Anfallsaktivität angestrebt wird. Aus…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde durch einen Zuschuss aus dem Horizon 2020-Arbeitsprogramm der Europäischen Union (Ausschreibung H2020-FETOPEN-2018-2020) im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung 964712 (PRIME; an M. Simonato) unterstützt.

Materials

Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok BD Italy SpA, Milan, Italy 367246 Material
Blood Collection tubes (Microtainer K2E) BD Italy SpA, Milan, Italy 365975 Material
Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm Nipro, Osaka, Japan  PSY-23-ET-ICU Material
Centrifuge refrigerated ALC PK 130R DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England 112000033 Material
Cotton suture 3-0 Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA 7343H Material
Diazepam 5 mg/2ml, Solupam Dechra Veterinary Products, Torino, Italy 105183014 (AIC) Solution
Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA PNM-VIDEO-008 Equipment
Digital video surveillance system of tethered EEG set up EZVIZ Network, Hangzhou, Cina EZVIZ (V5.3.2) Equipment
Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity Laboratoire Garcin-Bactinyl, France LB 920111 Solution
Dummy guide cannula 8 mm Agn Tho's, Lindigö, Sweden CXD-8 Material
Electrode 3-channel two-twisted Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA MS333/3-B/SPC Material
Electrode holder for stereotxic surgery Agn Tho's, Lindigö, Sweden 1776-P1 Equipment
Eppendorf BioSpectrometer basic Eppendorf AG, Hamburg, Germany 6137 Equipment

Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL
Eppendorf Srl, Milan, Italy 30124332 Material
Eppendorf μCuvette G1.0 Eppendorf AG, Hamburg, Germany 6138 Equipment
Feeding needle flexible 17G for rat Agn Tho's, Lindigö Sweden 7206 Material
Grass Technology apparatus Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA M665G08 Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
Isoflurane 100%, IsoFlo Zoetis, Rome, Italy 103287025 (AIC) Solution
Ketamine (Imalgene) Merial, Toulouse, France 221300288 (AIC) Solution
Lithium chloride  Sigma-Aldrich, Milan, Italy L9650 Material
Microinjection cannula 31G 9 mm Agn Tho's, Lindigö Sweden CXMI-9 Material
MP150 modular data acquisition and analysis system  Biopac, Goleta, California, USA MP150WSW Equipment
Ophthalmic vet ointment, Hylo night Ursapharm, Milan, Italy 941791927 (AIC) Material
Pilocarpine hydrochloride Sigma-Aldrich, Milan, Italy P6503 Material
PTFE Tube with joint Agn Tho's, Lindigö, Sweden JT-10 Material
Saline 0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0 Solution
Scopolamine hydrobromide trihydrate Sigma-Aldrich, Milan, Italy S2250 Material
Scopolamine methyl nitrate Sigma-Aldrich, Milan, Italy S1876 Material
Silver sulfadiazine 1% cream  Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy 025561010 (AIC) Material
Simplex rapid dental methacrylic cement   Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom ACR811 Material
Stereotaxic apparatus David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA Model 963 Equipment
Sucrose solution 10% sucrose in distilled water Home-made Solution
Syringe 1 mL  Biosigma, Cona, Venezia, Italy 20,71,26,03,00,350 Material
Telemeters Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA CTA-F40 Material
Telemetry EEG traces analyzer Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA NeuroScore v3-0 Equipment
Telemetry system Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA Hardware plus software Ponemah core 6.51 Equipment
Xylazine hydrochloride Sigma-Aldrich, Milan, Italy X1251 Material

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Soukupová, M., Guarino, A., Asth, L., Marino, P., Barbieri, M., Simonato, M., Zucchini, S. Sampling Cerebrospinal Fluid and Blood from Lateral Tail Vein in Rats During EEG Recordings. J. Vis. Exp. (199), e65636, doi:10.3791/65636 (2023).

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