الخلايا اللحمية الوسيطة المشتقة من الدهون المزروعة بشكل مشترك مع الخلايا الدبقية المختلطة الأولية لتقليل الالتهاب الناجم عن البريون
Summary
تتمتع الخلايا اللحمية المتوسطة المشتقة من الدهون (AdMSCs) بخصائص مناعية قوية مفيدة لعلاج الأمراض المرتبطة بالالتهاب. نوضح كيفية عزل وزراعة الفئران AdMSCs والدبقية المختلطة الأولية ، وتحفيز AdMSCs لتنظيم الجينات المضادة للالتهابات وعوامل النمو ، وتقييم هجرة AdMSCs ، و AdMSCs للثقافة المشتركة مع الخلايا الدبقية الأولية المصابة بالبريون المختلط.
Abstract
الخلايا اللحمية المتوسطة (MSCs) هي منظمات قوية للالتهابات من خلال إنتاج السيتوكينات المضادة للالتهابات ، والكيموكينات ، وعوامل النمو. تظهر هذه الخلايا القدرة على تنظيم الالتهاب العصبي في سياق الأمراض التنكسية العصبية مثل مرض البريون واضطرابات اختلال البروتين الأخرى. يمكن أن تكون أمراض البريون متفرقة أو مكتسبة أو وراثية. يمكن أن تنتج عن اختلال وتجميع بروتين البريون في الدماغ. هذه الأمراض قاتلة دائما ، مع عدم وجود علاجات متاحة.
واحدة من أولى علامات المرض هي تنشيط الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة والالتهابات المرتبطة بها ، والتي تحدث قبل تراكم البريون القابل للكشف وفقدان الخلايا العصبية. وبالتالي ، يمكن حصاد الخصائص المضادة للالتهابات والتنظيمية ل MSCs لعلاج داء النجوم في مرض البريون. في الآونة الأخيرة ، أظهرنا أن MSCs المشتقة من الدهون (AdMSCs) المزروعة بشكل مشترك مع خلايا BV2 أو الخلايا الدبقية المختلطة الأولية تقلل الالتهاب الناجم عن البريون من خلال إشارات paracrine. تصف هذه الورقة علاجا موثوقا به باستخدام AdMSCs المحفزة لتقليل الالتهاب الناجم عن البريون.
يمكن بسهولة عزل مجموعة متغايرة الزيجوت من AdMSCs من الأنسجة الدهنية للفئران وتوسيعها في الثقافة. إن تحفيز هذه الخلايا بالسيتوكينات الالتهابية يعزز قدرتها على الهجرة نحو تجانس الدماغ المصاب بالبريون وإنتاج معدلات مضادة للالتهابات استجابة لذلك. معا ، يمكن استخدام هذه التقنيات للتحقيق في الإمكانات العلاجية ل MSCs على عدوى البريون ويمكن تكييفها مع أمراض اختلال البروتين والالتهابات العصبية الأخرى.
Introduction
يلعب الالتهاب الدبقي دورا رئيسيا في مجموعة متنوعة من الأمراض التنكسية العصبية ، بما في ذلك مرض باركنسون والزهايمر ومرض البريون. على الرغم من أن تراكم البروتين غير الطبيعي يعزى إلى الكثير من التسبب في المرض والتنكس العصبي ، إلا أن الخلايا الدبقية تلعب أيضا دورا في تفاقم هذا 1،2،3. لذلك ، فإن استهداف الالتهاب الدبقي هو نهج علاجي واعد. في مرض البريون ، يختلط بروتين البريون الخلوي (PrPC) إلى بروتين البريون المرتبط بالمرض (PrPSc) ، والذي يشكل oligomers ويتجمع ويعطل التوازن في الدماغ 4،5،6.
واحدة من أولى علامات مرض البريون هي الاستجابة الالتهابية من الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة. أظهرت الدراسات التي تثبط هذه الاستجابة ، إما عن طريق إزالة الخلايا الدبقية الصغيرة أو تعديل الخلايا النجمية ، بشكل عام عدم وجود تحسن أو تفاقم التسبب في المرض في النماذج الحيوانية 7،8،9. يعد تعديل الالتهاب الدبقي دون القضاء عليه بديلا مثيرا للاهتمام كعلاج.
اتخذت الخلايا اللحمية المتوسطة (MSCs) المرحلة كعلاج لمجموعة متنوعة من الأمراض الالتهابية ، نظرا لقدرتها على تعديل الالتهاب بطريقة paracrine 10,11. لقد أظهروا القدرة على الهجرة إلى مواقع الالتهاب والاستجابة لجزيئات الإشارات في هذه البيئات عن طريق إفراز الجزيئات المضادة للالتهابات وعوامل النمو والحمض النووي الريبي الصغير والمزيد 10،12،13. لقد أثبتنا سابقا أن MSCs المشتقة من الأنسجة الدهنية (المشار إليها AdMSCs) قادرة على الهجرة نحو تجانس الدماغ المصاب بالبريون والاستجابة لهذا التجانس الدماغي عن طريق تنظيم التعبير الجيني للسيتوكينات المضادة للالتهابات وعوامل النمو.
علاوة على ذلك ، يمكن أن تقلل AdMSCs من التعبير عن الجينات المرتبطة بالعامل النووي-كابا B (NF-κB) ، ومجال بيرين عائلة المستقبلات الشبيهة بالإيماءة التي تحتوي على 3 (NLRP3) إشارات التهابية ، والتنشيط الدبقي ، في كل من الخلايا الدبقية الصغيرة BV2 والدبقية المختلطة الأولية 14. هنا ، نقدم بروتوكولات حول كيفية عزل كل من AdMSCs والدبقية المختلطة الأولية من الفئران ، وتحفيز AdMSCs على تنظيم الجينات المعدلة ، وتقييم هجرة AdMSC ، والمشاركة في زراعة AdMSCs مع الخلايا الدبقية المصابة بالبريون. نأمل أن توفر هذه الإجراءات أساسا لمزيد من التحقيق في دور MSCs في تنظيم الالتهاب الناجم عن الدبقية في الأمراض التنكسية العصبية وغيرها.
Protocol
Representative Results
Discussion
نوضح هنا بروتوكولا موثوقا وغير مكلف نسبيا لتقييم آثار الخلايا اللحمية المتوسطة المشتقة من الدهون (AdMSCs) في تقليل الالتهاب الناجم عن البريون في نموذج الخلايا الدبقية. يمكن بسهولة عزل AdMSCs وتوسيعها في الثقافة لاستخدامها في أقل من أسبوع 1. ينتج هذا البروتوكول باستمرار مجموعة غير متجانسة من الخ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون Lab Animal Resources على تربية. تشمل مصادر تمويلنا لهذه المخطوطة صندوق Boettcher ، وصندوق Murphy Turner ، وكلية CSU للطب البيطري ، ومجلس أبحاث كلية العلوم الطبية الحيوية. تم إنشاء الشكل 2A والشكل 2C والشكل 3A باستخدام BioRender.com.
Materials
| 0.25% Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| 5 mL serological pipets | Celltreat | 229005B | |
| 6-well tissue culture plates | Celltreat | 229106 | |
| 10 cm cell culture dishes | Peak Serum | PS-4002 | |
| 10 ml serological pipets | Celltreat | 229210 | |
| 15 mL conical tubes | Celltreat | 667015B | |
| 50 mL conical tubes | Celltreat | 667050B | |
| BV2 microglia cell line | AcceGen Biotech | ABC-TC212S | |
| Cell lifter | Biologix Research Company | 70-2180 | |
| Crystal violet | Electron Microscopy Sciences | 12785 | |
| Dispase | Thermo Scientific | 17105041 | |
| DMEM/F12 | Caisson Labs | DFL14-500ML | |
| DNase-I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| Essential amino acids | Thermo Scientific | 11130051 | |
| Ethanol (100%) | EMD Millipore | EX0276-1 | |
| Fetal bovine serum (heat inactivated) | Peak Serum | PS-FB4 | Can be purchased as heat inactivated or inactivated in the laboratory |
| Formaldehyde | EMD Millipore | 1.04003.1000 | |
| Glass 10 mL serological pipet | Corning | 7077-10N | |
| Hank’s Balances Salt Solution | Sigma Aldrich | H8264-500ML | |
| Hemocytometer/Neubauer Chamber | Daigger | HU-3100 | |
| High Glucose DMEM | Cytiva | SH30022.01 | |
| low glucose DMEM containing L-glutamine | Cytiva | SH30021.01 | |
| MEM/EBSS | Cytiva | SH30024.FS | |
| non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145-100M | |
| Paraformaldehyde (16%) | MP Biomedicals | 219998320 | |
| Penicillin/streptomycin/neomycin | Sigma-Aldrich | P4083-100ML | |
| Phosphate buffered saline | Cytiva | SH30256.01 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D Systems | 485-MI | |
| Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CF | R&D Systems | 410-MT | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Coat inside of glass pipets by aspirating up and down twice in Sigmacote and allowing to dry thoroughly. Wrap in aluminum foil and autoclave pipets 24 h later. |
| Stemxyme | Worthington Biochemical Corporation | LS004106 | Collagenase/Dispase mixture |
| Sterile, individually wrapped cotton swab | Puritan Medical | 25-8061WC | |
| Thincert Tissue Culture Inserts, 24 well, Pore Size=8 µm | Greiner Bio-One | 662638 | |
| Thincert Tissue Culture Inserts, 6 well, Pore Size=0.4 µm | Greiner Bio-One | 657641 |
References
- Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541 (7638), 481-487 (2017).
- Smith, H. L., et al. Astrocyte unfolded protein response induces a specific reactivity state that causes non-cell-autonomous neuronal degeneration. Neuron. 105 (5), 855-866 (2020).
- Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
- Collinge, J., Clarke, A. R. A general model of prion strains and their pathogenicity. Science. 318 (5852), 930-936 (2007).
- Gajdusek, D. C. Transmissible and non-transmissible amyloidoses: autocatalytic post-translational conversion of host precursor proteins to beta-pleated sheet configurations. J Neuroimmunol. 20 (2-3), 95-110 (1988).
- Come, J. H., Fraser, P. E., Lansbury, P. T. A kinetic model for amyloid formation in the prion diseases: importance of seeding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (13), 5959-5963 (1993).
- Hartmann, K., et al. Complement 3(+)-astrocytes are highly abundant in prion diseases, but their abolishment led to an accelerated disease course and early dysregulation of microglia. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 83 (2019).
- Carroll, J. A., Race, B., Williams, K., Striebel, J., Chesebro, B. Microglia are critical in host defense against prion disease. Journal of Virology. 92 (15), e00549 (2018).
- Bradford, B. M., McGuire, L. I., Hume, D. A., Pridans, C., Mabbott, N. A. Microglia deficiency accelerates prion disease but does not enhance prion accumulation in the brain. Glia. 70 (11), 2169-2187 (2022).
- Li, M., Chen, H., Zhu, M. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine in central nervous system. Frontiers in Neuroscience. 16, 1068114 (2022).
- Sanchez-Castillo, A. I., et al. Switching roles: beneficial effects of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells on microglia and their implication in neurodegenerative diseases. Biomolecules. 12 (2), 219 (2022).
- Fu, X., et al. Mesenchymal stem cell migration and tissue repair. Cells. 8 (8), 784 (2019).
- Xiao, Q., et al. TNF-alpha increases bone marrow mesenchymal stem cell migration to ischemic tissues. Cell Biochemistry and Biophysics. 62 (3), 409-414 (2012).
- Hay, A. J. D., Murphy, T. J., Popichak, K. A., Zabel, M. D., Moreno, J. A. Adipose-derived mesenchymal stromal cells decrease prion-induced glial inflammation in vitro. Scientific Reports. 12 (1), 22567 (2022).
- Kirkley, K. S., Popichak, K. A., Afzali, M. F., Legare, M. E., Tjalkens, R. B. Microglia amplify inflammatory activation of astrocytes in manganese neurotoxicity. Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 99 (2017).
- Popichak, K. A., Afzali, M. F., Kirkley, K. S., Tjalkens, R. B. Glial-neuronal signaling mechanisms underlying the neuroinflammatory effects of manganese. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 324 (2018).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Hass, R., Otte, A. Mesenchymal stem cells as all-round supporters in a normal and neoplastic microenvironment. Cell Communication and Signaling: CCS. 10 (1), 26 (2012).
- Carroll, J. A., et al. Prion strain differences in accumulation of PrPSc on neurons and glia are associated with similar expression profiles of neuroinflammatory genes: comparison of three prion strains. PLoS Pathogens. 12 (4), 1005551 (2016).
- Carroll, J. A., Race, B., Williams, K., Chesebro, B. Toll-like receptor 2 confers partial neuroprotection during prion disease. PLoS One. 13 (12), e0208559 (2018).
- Yu, Y., et al. Hypoxia and low-dose inflammatory stimulus synergistically enhance bone marrow mesenchymal stem cell migration. Cell Proliferation. 50 (1), e12309 (2017).
- Hay, A. J. D., et al. Intranasally delivered mesenchymal stromal cells decrease glial inflammation early in prion disease. Frontiers in Neuroscience. 17, 1158408 (2023).
- English, K., Barry, F. P., Field-Corbett, C. P., Mahon, B. P. IFN-gamma and TNF-alpha differentially regulate immunomodulation by murine mesenchymal stem cells. Immunology Letters. 110 (2), 91-100 (2007).
- Hemeda, H., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha differentially affect cytokine expression and migration properties of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 19 (5), 693-706 (2010).
- Carta, M., Aguzzi, A. Molecular foundations of prion strain diversity. Current Opinion in Neurobiology. 72, 22-31 (2022).
- Yu, F., et al. Phagocytic microglia and macrophages in brain injury and repair. CNS Neuroscience and Therapeutics. 28 (9), 1279-1293 (2022).
- Sinha, A., et al. Phagocytic activities of reactive microglia and astrocytes associated with prion diseases are dysregulated in opposite directions. Cells. 10 (7), 1728 (2021).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer’s disease. Journal of Neuroinflammation. 9, 115 (2012).
- Shan, Z., et al. Therapeutic effect of autologous compact bone-derived mesenchymal stem cell transplantation on prion disease. Journal of General Virology. 98 (10), 2615-2627 (2017).
- Johnson, T. E., et al. Monitoring immune cells trafficking fluorescent prion rods hours after intraperitoneal infection. Journal of Visualized Experiments. (45), e2349 (2010).
- Liu, F., et al. MSC-secreted TGF-beta regulates lipopolysaccharide-stimulated macrophage M2-like polarization via the Akt/FoxO1 pathway. Stem Cell Research and Therapy. 10, 345 (2019).
