脂肪由来間葉系間質細胞を初代混合グリアと共培養したプリオン誘発性炎症の軽減
Summary
脂肪由来間葉系間質細胞(AdMSC)は、炎症に関連する疾患の治療に有用な強力な免疫調節特性を持っています。マウスのAdMSCと一次混合グリアの単離と培養、AdMSCの刺激による抗炎症遺伝子と成長因子のアップレギュレーション、AdMSCの遊走の評価、およびAdMSCと一次混合プリオン感染グリアとの共培養方法を示します。
Abstract
間葉系間質細胞(MSC)は、抗炎症性サイトカイン、ケモカイン、および成長因子の産生を通じて炎症を強力に調節します。これらの細胞は、プリオン病やその他のタンパク質のミスフォールディング障害などの神経変性疾患の状況で神経炎症を調節する能力を示しています。プリオン病は、散発性、後天性、または遺伝性の場合があります。これらは、脳内のプリオンタンパク質のミスフォールディングと凝集に起因する可能性があります。これらの病気は常に致命的であり、利用可能な治療法はありません。
疾患の最も初期の兆候の1つは、アストロサイトとミクログリアの活性化とそれに伴う炎症であり、これは検出可能なプリオン凝集とニューロンの喪失の前に発生します。したがって、MSCの抗炎症および調節特性は、プリオン病のアストログリオーシスを治療するために収穫することができます。最近、BV2細胞または初代混合グリアと共培養した脂肪由来MSC(AdMSC)が、パラクリンシグナル伝達を通じてプリオン誘発性炎症を軽減することを示しました。この論文では、プリオン誘発性炎症を減少させるために刺激されたAdMSCを使用した信頼性の高い治療法について説明しています。
AdMSCのヘテロ接合集団は、マウス脂肪組織から容易に単離し、培養中に拡大することができます。これらの細胞を炎症性サイトカインで刺激すると、プリオンに感染した脳のホモジネートに向かって移動する能力と、それに反応して抗炎症モジュレーターを産生する能力が向上します。これらの技術を組み合わせることで、プリオン感染に対するMSCの治療可能性を調査することができ、他のタンパク質のミスフォールディングや神経炎症性疾患にも適応させることができます。
Introduction
グリア炎症は、パーキンソン病、アルツハイマー病、プリオン病など、さまざまな神経変性疾患で重要な役割を果たしています。異常なタンパク質凝集は、疾患の病因や神経変性の多くに起因していますが、グリア細胞もこの1,2,3を悪化させる役割を果たしています。したがって、グリア誘発性炎症を標的とすることは有望な治療アプローチです。プリオン病では、細胞のプリオンタンパク質(PrPC)が疾患関連プリオンタンパク質(PrPSc)に誤ってフォールドし、オリゴマーを形成して凝集し、脳内の恒常性を破壊する4,5,6。
プリオン病の最も初期の徴候の1つは、アストロサイトとミクログリアからの炎症反応です。ミクログリアの除去またはアストロサイトの改変によってこの応答を抑制した研究では、一般に、動物モデル7,8,9の疾患病因の改善または悪化は示されていません。グリアの炎症を排除せずに調節することは、治療薬として興味深い代替手段です。
間葉系間質細胞(MSC)は、パラクリン方式で炎症を調節する能力があるため、さまざまな炎症性疾患の治療薬として登場しています10,11。彼らは、抗炎症分子、成長因子、マイクロRNAなどを分泌することにより、炎症部位に移動し、これらの環境でシグナル伝達分子に応答する能力を示しました10,12,13。私たちはこれまでに、脂肪組織に由来するMSC(AdMSCと表記)がプリオン感染脳ホモジネートに向かって移動し、抗炎症性サイトカインと成長因子の遺伝子発現をアップレギュレーションすることにより、この脳ホモジネートに応答できることを実証しました。
さらに、AdMSCは、BV2ミクログリアと一次混合グリアの両方において、Nuclear Factor-kappa B(NF-κB)、Nod様受容体ファミリーのピリンドメインを含む3(NLRP3)インフラマソームシグナル伝達、およびグリア活性化に関連する遺伝子の発現を減少させる可能性があります 14。ここでは、マウスからAdMSCと一次混合グリアの両方を単離する方法、AdMSCを刺激して調節遺伝子をアップレギュレーションする方法、AdMSC遊走を評価する方法、およびプリオン感染グリアとAdMSCを共培養する方法に関するプロトコルを提供します。これらの手順が、神経変性疾患やその他の疾患におけるグリア誘発性炎症の調節におけるMSCの役割をさらに研究するための基盤を提供できることを願っています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、グリア細胞モデルにおけるプリオン誘発性炎症の減少における脂肪由来間葉系間質細胞(AdMSC)の影響を評価するための、信頼性が高く比較的安価なプロトコルを示します。AdMSCは、わずか1週間で簡単に分離および培養して使用できます。このプロトコルは、免疫蛍光およびフローサイトメトリーによって間葉系間質細胞のマーカーと一致するマーカーを発現する細胞の異種集団を一…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、Lab Animal Resourcesの畜産に感謝しています。この原稿の資金源には、Boettcher Fund、Murphy Turner Fund、CSU College of Veterinary Medicine、Biomedical Sciences College Research Councilが含まれます。図 2A、図 2C、 および図 3A は、BioRender.com を使用して作成されました。
Materials
| 0.25% Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| 5 mL serological pipets | Celltreat | 229005B | |
| 6-well tissue culture plates | Celltreat | 229106 | |
| 10 cm cell culture dishes | Peak Serum | PS-4002 | |
| 10 ml serological pipets | Celltreat | 229210 | |
| 15 mL conical tubes | Celltreat | 667015B | |
| 50 mL conical tubes | Celltreat | 667050B | |
| BV2 microglia cell line | AcceGen Biotech | ABC-TC212S | |
| Cell lifter | Biologix Research Company | 70-2180 | |
| Crystal violet | Electron Microscopy Sciences | 12785 | |
| Dispase | Thermo Scientific | 17105041 | |
| DMEM/F12 | Caisson Labs | DFL14-500ML | |
| DNase-I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| Essential amino acids | Thermo Scientific | 11130051 | |
| Ethanol (100%) | EMD Millipore | EX0276-1 | |
| Fetal bovine serum (heat inactivated) | Peak Serum | PS-FB4 | Can be purchased as heat inactivated or inactivated in the laboratory |
| Formaldehyde | EMD Millipore | 1.04003.1000 | |
| Glass 10 mL serological pipet | Corning | 7077-10N | |
| Hank’s Balances Salt Solution | Sigma Aldrich | H8264-500ML | |
| Hemocytometer/Neubauer Chamber | Daigger | HU-3100 | |
| High Glucose DMEM | Cytiva | SH30022.01 | |
| low glucose DMEM containing L-glutamine | Cytiva | SH30021.01 | |
| MEM/EBSS | Cytiva | SH30024.FS | |
| non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145-100M | |
| Paraformaldehyde (16%) | MP Biomedicals | 219998320 | |
| Penicillin/streptomycin/neomycin | Sigma-Aldrich | P4083-100ML | |
| Phosphate buffered saline | Cytiva | SH30256.01 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D Systems | 485-MI | |
| Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CF | R&D Systems | 410-MT | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Coat inside of glass pipets by aspirating up and down twice in Sigmacote and allowing to dry thoroughly. Wrap in aluminum foil and autoclave pipets 24 h later. |
| Stemxyme | Worthington Biochemical Corporation | LS004106 | Collagenase/Dispase mixture |
| Sterile, individually wrapped cotton swab | Puritan Medical | 25-8061WC | |
| Thincert Tissue Culture Inserts, 24 well, Pore Size=8 µm | Greiner Bio-One | 662638 | |
| Thincert Tissue Culture Inserts, 6 well, Pore Size=0.4 µm | Greiner Bio-One | 657641 |
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