Van vet afgeleide mesenchymale stromale cellen in co-cultuur met primaire gemengde glia om door prionen geïnduceerde ontsteking te verminderen
Summary
Van vet afgeleide mesenchymale stromale cellen (AdMSC’s) hebben krachtige immunomodulerende eigenschappen die nuttig zijn voor de behandeling van ziekten die verband houden met ontstekingen. We demonstreren hoe AdMSC’s van muizen en primaire gemengde glia kunnen worden geïsoleerd en gekweekt, AdMSC’s kunnen worden gestimuleerd om ontstekingsremmende genen en groeifactoren te reguleren, migratie van AdMSC’s kunnen worden beoordeeld en AdMSC’s kunnen worden gekweekt met primaire gemengde prion-geïnfecteerde glia.
Abstract
Mesenchymale stromale cellen (MSC’s) zijn krachtige regulatoren van ontstekingen door de productie van ontstekingsremmende cytokines, chemokinen en groeifactoren. Deze cellen vertonen het vermogen om neuro-inflammatie te reguleren in de context van neurodegeneratieve ziekten zoals prionziekte en andere stoornissen in het verkeerd vouwen van eiwitten. Prionziekten kunnen sporadisch, verworven of genetisch zijn; Ze kunnen het gevolg zijn van het verkeerd vouwen en aggregeren van het prioneiwit in de hersenen. Deze ziekten zijn steevast dodelijk, zonder dat er behandelingen beschikbaar zijn.
Een van de vroegste tekenen van ziekte is de activering van astrocyten en microglia en de daarmee gepaard gaande ontsteking, die optreedt voorafgaand aan detecteerbare prionaggregatie en neuronaal verlies; zo kunnen de ontstekingsremmende en regulerende eigenschappen van MSC’s worden geoogst om astrogliose bij prionziekte te behandelen. Onlangs hebben we aangetoond dat van vet afgeleide MSC’s (AdMSC’s) in co-cultuur met BV2-cellen of primaire gemengde glia prion-geïnduceerde ontsteking verminderen door paracriene signalering. Dit artikel beschrijft een betrouwbare behandeling met behulp van gestimuleerde AdMSC’s om door prionen geïnduceerde ontsteking te verminderen.
Een heterozygote populatie van AdMSC’s kan gemakkelijk worden geïsoleerd uit vetweefsel van muizen en in cultuur worden uitgebreid. Het stimuleren van deze cellen met inflammatoire cytokines verbetert hun vermogen om zowel te migreren naar prion-geïnfecteerde hersenhomogenen als als reactie daarop ontstekingsremmende modulatoren te produceren. Samen kunnen deze technieken worden gebruikt om het therapeutisch potentieel van MSC’s bij prioninfectie te onderzoeken en kunnen ze worden aangepast voor andere eiwitmisvouwing en neuro-inflammatoire ziekten.
Introduction
Glia-ontsteking speelt een sleutelrol bij een verscheidenheid aan neurodegeneratieve ziekten, waaronder Parkinson, Alzheimer en prionziekte. Hoewel abnormale eiwitaggregatie wordt toegeschreven aan een groot deel van de pathogenese en neurodegeneratie van de ziekte, spelen gliacellen ook een rol bij het verergeren van deze 1,2,3. Daarom is het aanpakken van door glia geïnduceerde ontsteking een veelbelovende therapeutische benadering. Bij prionziekte vouwt het cellulaire prioneiwit (PrPC) zich mis met het ziekte-geassocieerde prioneiwit (PrPSc), dat oligomeren en aggregaten vormt en de homeostase in de hersenen verstoort 4,5,6.
Een van de eerste tekenen van prionziekte is een ontstekingsreactie van astrocyten en microglia. Studies die deze respons onderdrukken, hetzij door verwijdering van microglia of modificatie van astrocyten, hebben over het algemeen geen verbetering of verslechtering van de pathogenese van de ziekte aangetoond in diermodellen 7,8,9. Het moduleren van glia-ontsteking zonder deze te elimineren is een intrigerend alternatief als therapeutisch middel.
Mesenchymale stromale cellen (MSC’s) hebben het podium ingenomen als behandeling voor een verscheidenheid aan ontstekingsziekten, vanwege hun vermogen om ontstekingen op een paracriene manier te moduleren 10,11. Ze hebben het vermogen aangetoond om te migreren naar ontstekingsplaatsen en te reageren op signaalmoleculen in deze omgevingen door ontstekingsremmende moleculen, groeifactoren, microRNA’s en meer af te scheiden 10,12,13. We hebben eerder aangetoond dat MSC’s afgeleid van vetweefsel (aangeduid als AdMSC’s) in staat zijn om te migreren naar prion-geïnfecteerde hersenhomogenaat en op dit hersenhomogenaat te reageren door genexpressie voor ontstekingsremmende cytokines en groeifactoren te verhogen.
Bovendien kunnen AdMSC’s de expressie verminderen van genen die geassocieerd zijn met Nuclear Factor-kappa B (NF-κB), het Nod-Like Receptor-familie pyrinedomein dat 3 (NLRP3) inflammasoomsignalering bevat, en glia-activering, in zowel BV2-microglia als primair gemengd glia 14. Hier bieden we protocollen voor het isoleren van zowel AdMSC’s als primaire gemengde glia van muizen, het stimuleren van AdMSC’s om modulerende genen te reguleren, het beoordelen van AdMSC-migratie en het co-kweken van AdMSC’s met prion-geïnfecteerde glia. We hopen dat deze procedures een basis kunnen vormen voor verder onderzoek naar de rol van MSC’s bij het reguleren van glia-geïnduceerde ontsteking bij neurodegeneratieve en andere ziekten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier demonstreren we een betrouwbaar en relatief goedkoop protocol voor het beoordelen van de effecten van van vet afgeleide mesenchymale stromale cellen (AdMSC’s) bij het verminderen van prion-geïnduceerde ontsteking in een gliacelmodel. AdMSC’s kunnen gemakkelijk worden geïsoleerd en in cultuur worden uitgebreid voor gebruik in slechts 1 week. Dit protocol produceert consequent een heterologe populatie van cellen die markers tot expressie brengen die consistent zijn met die van mesenchymale stromale cellen door immun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Lab Animal Resources voor hun veeteelt. Onze financieringsbronnen voor dit manuscript zijn onder meer het Boettcher Fund, het Murphy Turner Fund, CSU College of Veterinary Medicine en de Biomedical Sciences College Research Council. Figuur 2A, Figuur 2C en Figuur 3A zijn gemaakt met BioRender.com.
Materials
| 0.25% Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| 5 mL serological pipets | Celltreat | 229005B | |
| 6-well tissue culture plates | Celltreat | 229106 | |
| 10 cm cell culture dishes | Peak Serum | PS-4002 | |
| 10 ml serological pipets | Celltreat | 229210 | |
| 15 mL conical tubes | Celltreat | 667015B | |
| 50 mL conical tubes | Celltreat | 667050B | |
| BV2 microglia cell line | AcceGen Biotech | ABC-TC212S | |
| Cell lifter | Biologix Research Company | 70-2180 | |
| Crystal violet | Electron Microscopy Sciences | 12785 | |
| Dispase | Thermo Scientific | 17105041 | |
| DMEM/F12 | Caisson Labs | DFL14-500ML | |
| DNase-I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| Essential amino acids | Thermo Scientific | 11130051 | |
| Ethanol (100%) | EMD Millipore | EX0276-1 | |
| Fetal bovine serum (heat inactivated) | Peak Serum | PS-FB4 | Can be purchased as heat inactivated or inactivated in the laboratory |
| Formaldehyde | EMD Millipore | 1.04003.1000 | |
| Glass 10 mL serological pipet | Corning | 7077-10N | |
| Hank’s Balances Salt Solution | Sigma Aldrich | H8264-500ML | |
| Hemocytometer/Neubauer Chamber | Daigger | HU-3100 | |
| High Glucose DMEM | Cytiva | SH30022.01 | |
| low glucose DMEM containing L-glutamine | Cytiva | SH30021.01 | |
| MEM/EBSS | Cytiva | SH30024.FS | |
| non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145-100M | |
| Paraformaldehyde (16%) | MP Biomedicals | 219998320 | |
| Penicillin/streptomycin/neomycin | Sigma-Aldrich | P4083-100ML | |
| Phosphate buffered saline | Cytiva | SH30256.01 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D Systems | 485-MI | |
| Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CF | R&D Systems | 410-MT | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Coat inside of glass pipets by aspirating up and down twice in Sigmacote and allowing to dry thoroughly. Wrap in aluminum foil and autoclave pipets 24 h later. |
| Stemxyme | Worthington Biochemical Corporation | LS004106 | Collagenase/Dispase mixture |
| Sterile, individually wrapped cotton swab | Puritan Medical | 25-8061WC | |
| Thincert Tissue Culture Inserts, 24 well, Pore Size=8 µm | Greiner Bio-One | 662638 | |
| Thincert Tissue Culture Inserts, 6 well, Pore Size=0.4 µm | Greiner Bio-One | 657641 |
References
- Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541 (7638), 481-487 (2017).
- Smith, H. L., et al. Astrocyte unfolded protein response induces a specific reactivity state that causes non-cell-autonomous neuronal degeneration. Neuron. 105 (5), 855-866 (2020).
- Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
- Collinge, J., Clarke, A. R. A general model of prion strains and their pathogenicity. Science. 318 (5852), 930-936 (2007).
- Gajdusek, D. C. Transmissible and non-transmissible amyloidoses: autocatalytic post-translational conversion of host precursor proteins to beta-pleated sheet configurations. J Neuroimmunol. 20 (2-3), 95-110 (1988).
- Come, J. H., Fraser, P. E., Lansbury, P. T. A kinetic model for amyloid formation in the prion diseases: importance of seeding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (13), 5959-5963 (1993).
- Hartmann, K., et al. Complement 3(+)-astrocytes are highly abundant in prion diseases, but their abolishment led to an accelerated disease course and early dysregulation of microglia. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 83 (2019).
- Carroll, J. A., Race, B., Williams, K., Striebel, J., Chesebro, B. Microglia are critical in host defense against prion disease. Journal of Virology. 92 (15), e00549 (2018).
- Bradford, B. M., McGuire, L. I., Hume, D. A., Pridans, C., Mabbott, N. A. Microglia deficiency accelerates prion disease but does not enhance prion accumulation in the brain. Glia. 70 (11), 2169-2187 (2022).
- Li, M., Chen, H., Zhu, M. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine in central nervous system. Frontiers in Neuroscience. 16, 1068114 (2022).
- Sanchez-Castillo, A. I., et al. Switching roles: beneficial effects of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells on microglia and their implication in neurodegenerative diseases. Biomolecules. 12 (2), 219 (2022).
- Fu, X., et al. Mesenchymal stem cell migration and tissue repair. Cells. 8 (8), 784 (2019).
- Xiao, Q., et al. TNF-alpha increases bone marrow mesenchymal stem cell migration to ischemic tissues. Cell Biochemistry and Biophysics. 62 (3), 409-414 (2012).
- Hay, A. J. D., Murphy, T. J., Popichak, K. A., Zabel, M. D., Moreno, J. A. Adipose-derived mesenchymal stromal cells decrease prion-induced glial inflammation in vitro. Scientific Reports. 12 (1), 22567 (2022).
- Kirkley, K. S., Popichak, K. A., Afzali, M. F., Legare, M. E., Tjalkens, R. B. Microglia amplify inflammatory activation of astrocytes in manganese neurotoxicity. Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 99 (2017).
- Popichak, K. A., Afzali, M. F., Kirkley, K. S., Tjalkens, R. B. Glial-neuronal signaling mechanisms underlying the neuroinflammatory effects of manganese. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 324 (2018).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Hass, R., Otte, A. Mesenchymal stem cells as all-round supporters in a normal and neoplastic microenvironment. Cell Communication and Signaling: CCS. 10 (1), 26 (2012).
- Carroll, J. A., et al. Prion strain differences in accumulation of PrPSc on neurons and glia are associated with similar expression profiles of neuroinflammatory genes: comparison of three prion strains. PLoS Pathogens. 12 (4), 1005551 (2016).
- Carroll, J. A., Race, B., Williams, K., Chesebro, B. Toll-like receptor 2 confers partial neuroprotection during prion disease. PLoS One. 13 (12), e0208559 (2018).
- Yu, Y., et al. Hypoxia and low-dose inflammatory stimulus synergistically enhance bone marrow mesenchymal stem cell migration. Cell Proliferation. 50 (1), e12309 (2017).
- Hay, A. J. D., et al. Intranasally delivered mesenchymal stromal cells decrease glial inflammation early in prion disease. Frontiers in Neuroscience. 17, 1158408 (2023).
- English, K., Barry, F. P., Field-Corbett, C. P., Mahon, B. P. IFN-gamma and TNF-alpha differentially regulate immunomodulation by murine mesenchymal stem cells. Immunology Letters. 110 (2), 91-100 (2007).
- Hemeda, H., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha differentially affect cytokine expression and migration properties of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 19 (5), 693-706 (2010).
- Carta, M., Aguzzi, A. Molecular foundations of prion strain diversity. Current Opinion in Neurobiology. 72, 22-31 (2022).
- Yu, F., et al. Phagocytic microglia and macrophages in brain injury and repair. CNS Neuroscience and Therapeutics. 28 (9), 1279-1293 (2022).
- Sinha, A., et al. Phagocytic activities of reactive microglia and astrocytes associated with prion diseases are dysregulated in opposite directions. Cells. 10 (7), 1728 (2021).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer’s disease. Journal of Neuroinflammation. 9, 115 (2012).
- Shan, Z., et al. Therapeutic effect of autologous compact bone-derived mesenchymal stem cell transplantation on prion disease. Journal of General Virology. 98 (10), 2615-2627 (2017).
- Johnson, T. E., et al. Monitoring immune cells trafficking fluorescent prion rods hours after intraperitoneal infection. Journal of Visualized Experiments. (45), e2349 (2010).
- Liu, F., et al. MSC-secreted TGF-beta regulates lipopolysaccharide-stimulated macrophage M2-like polarization via the Akt/FoxO1 pathway. Stem Cell Research and Therapy. 10, 345 (2019).
