Cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux co-cultivées avec des cellules gliales mixtes primaires pour réduire l’inflammation induite par les prions
Summary
Les cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (AdMSC) ont de puissantes propriétés immunomodulatrices utiles pour traiter les maladies associées à l’inflammation. Nous montrons comment isoler et cultiver des AdMSC murins et des cellules gliales mixtes primaires, stimuler les AdMSCs pour réguler à la hausse les gènes anti-inflammatoires et les facteurs de croissance, évaluer la migration des AdMSCs et co-cultiver des AdMSCs avec des cellules gliales mixtes primaires infectées par des prions.
Abstract
Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont de puissants régulateurs de l’inflammation grâce à la production de cytokines anti-inflammatoires, de chimiokines et de facteurs de croissance. Ces cellules montrent une capacité à réguler la neuroinflammation dans le contexte de maladies neurodégénératives telles que la maladie à prions et d’autres troubles du mauvais repliement des protéines. Les maladies à prions peuvent être sporadiques, acquises ou génétiques ; Ils peuvent résulter du mauvais repliement et de l’agrégation de la protéine prion dans le cerveau. Ces maladies sont invariablement mortelles, sans traitement disponible.
L’un des premiers signes de la maladie est l’activation des astrocytes et de la microglie et l’inflammation associée, qui se produit avant l’agrégation détectable des prions et la perte neuronale ; ainsi, les propriétés anti-inflammatoires et régulatrices des CSM peuvent être récoltées pour traiter l’astrogliose dans la maladie à prions. Récemment, nous avons montré que les CSM dérivées du tissu adipeux (AdMSC) co-cultivées avec des cellules BV2 ou des cellules gliales mixtes primaires réduisent l’inflammation induite par les prions par la signalisation paracrine. Cet article décrit un traitement fiable utilisant des AdMSC stimulées pour réduire l’inflammation induite par les prions.
Une population hétérozygote d’AdMSC peut facilement être isolée du tissu adipeux murin et développée en culture. La stimulation de ces cellules avec des cytokines inflammatoires améliore leur capacité à migrer vers l’homogénat cérébral infecté par les prions et à produire des modulateurs anti-inflammatoires en réponse. Ensemble, ces techniques peuvent être utilisées pour étudier le potentiel thérapeutique des CSM sur l’infection à prions et peuvent être adaptées à d’autres maladies neuro-inflammatoires et de mauvais repliement des protéines.
Introduction
L’inflammation gliale joue un rôle clé dans diverses maladies neurodégénératives, notamment la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer et les maladies à prions. Bien que l’agrégation anormale des protéines soit attribuée à une grande partie de la pathogenèse de la maladie et de la neurodégénérescence, les cellules gliales jouent également un rôle dans l’exacerbation de ce 1,2,3. Par conséquent, cibler l’inflammation induite par les glies est une approche thérapeutique prometteuse. Dans la maladie à prions, la protéine prion cellulaire (PrPC) se replie à tort en protéine prion associée à la maladie (PrPSc), qui forme des oligomères et s’agrège et perturbe l’homéostasie dans le cerveau 4,5,6.
L’un des premiers signes de maladie à prions est une réponse inflammatoire des astrocytes et de la microglie. Les études supprimant cette réponse, soit par l’ablation de la microglie, soit par la modification des astrocytes, n’ont généralement montré aucune amélioration ou une aggravation de la pathogenèse de la maladie dans des modèles animaux 7,8,9. Moduler l’inflammation gliale sans l’éliminer est une alternative thérapeutique intrigante.
Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) ont pris le devant de la scène en tant que traitement de diverses maladies inflammatoires, en raison de leur capacité à moduler l’inflammation de manière paracrine 10,11. Ils ont montré la capacité de migrer vers des sites d’inflammation et de répondre aux molécules de signalisation dans ces environnements en sécrétant des molécules anti-inflammatoires, des facteurs de croissance, des microARN, etc. 10,12,13. Nous avons précédemment démontré que les CSM dérivées du tissu adipeux (appelées AdMSC) sont capables de migrer vers l’homogénat cérébral infecté par des prions et de répondre à cet homogénat cérébral en régulant à la hausse l’expression des gènes des cytokines anti-inflammatoires et des facteurs de croissance.
De plus, les AdMSCs peuvent diminuer l’expression des gènes associés au facteur nucléaire-kappa B (NF-κB), à la signalisation de l’inflammasome de la famille des récepteurs de type Nod (NLRP3) et à l’activation gliale, à la fois dans la microglie BV2 et la glie mixte primaire 14. Ici, nous fournissons des protocoles sur la façon d’isoler à la fois les AdMSCs et les cellules gliales mixtes primaires de souris, de stimuler les AdMSCs pour réguler à la hausse les gènes modulateurs, d’évaluer la migration des AdMSC et de co-cultiver des AdMSCs avec des cellules gliales infectées par des prions. Nous espérons que ces procédures pourront fournir une base pour des recherches plus approfondies sur le rôle des CSM dans la régulation de l’inflammation induite par la glie dans les maladies neurodégénératives et autres.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous démontrons un protocole fiable et relativement peu coûteux pour évaluer les effets des cellules stromales mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (AdMSC) dans la diminution de l’inflammation induite par les prions dans un modèle de cellules gliales. Les AdMSCs peuvent facilement être isolées et développées en culture pour une utilisation en aussi peu qu’une semaine. Ce protocole produit systématiquement une population hétérologue de cellules qui expriment des marqueurs compatibles avec ceux…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Lab Animal Resources pour leur élevage. Nos sources de financement pour ce manuscrit comprennent le Fonds Boettcher, le Fonds Murphy Turner, le Collège de médecine vétérinaire CSU et le Conseil de recherche du Collège des sciences biomédicales. Les figures 2A, 2C et 3A ont été créées avec BioRender.com.
Materials
| 0.25% Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| 5 mL serological pipets | Celltreat | 229005B | |
| 6-well tissue culture plates | Celltreat | 229106 | |
| 10 cm cell culture dishes | Peak Serum | PS-4002 | |
| 10 ml serological pipets | Celltreat | 229210 | |
| 15 mL conical tubes | Celltreat | 667015B | |
| 50 mL conical tubes | Celltreat | 667050B | |
| BV2 microglia cell line | AcceGen Biotech | ABC-TC212S | |
| Cell lifter | Biologix Research Company | 70-2180 | |
| Crystal violet | Electron Microscopy Sciences | 12785 | |
| Dispase | Thermo Scientific | 17105041 | |
| DMEM/F12 | Caisson Labs | DFL14-500ML | |
| DNase-I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| Essential amino acids | Thermo Scientific | 11130051 | |
| Ethanol (100%) | EMD Millipore | EX0276-1 | |
| Fetal bovine serum (heat inactivated) | Peak Serum | PS-FB4 | Can be purchased as heat inactivated or inactivated in the laboratory |
| Formaldehyde | EMD Millipore | 1.04003.1000 | |
| Glass 10 mL serological pipet | Corning | 7077-10N | |
| Hank’s Balances Salt Solution | Sigma Aldrich | H8264-500ML | |
| Hemocytometer/Neubauer Chamber | Daigger | HU-3100 | |
| High Glucose DMEM | Cytiva | SH30022.01 | |
| low glucose DMEM containing L-glutamine | Cytiva | SH30021.01 | |
| MEM/EBSS | Cytiva | SH30024.FS | |
| non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145-100M | |
| Paraformaldehyde (16%) | MP Biomedicals | 219998320 | |
| Penicillin/streptomycin/neomycin | Sigma-Aldrich | P4083-100ML | |
| Phosphate buffered saline | Cytiva | SH30256.01 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D Systems | 485-MI | |
| Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CF | R&D Systems | 410-MT | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Coat inside of glass pipets by aspirating up and down twice in Sigmacote and allowing to dry thoroughly. Wrap in aluminum foil and autoclave pipets 24 h later. |
| Stemxyme | Worthington Biochemical Corporation | LS004106 | Collagenase/Dispase mixture |
| Sterile, individually wrapped cotton swab | Puritan Medical | 25-8061WC | |
| Thincert Tissue Culture Inserts, 24 well, Pore Size=8 µm | Greiner Bio-One | 662638 | |
| Thincert Tissue Culture Inserts, 6 well, Pore Size=0.4 µm | Greiner Bio-One | 657641 |
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