Células estromais mesenquimais derivadas de tecido adiposo co-cultivadas com glia mista primária para reduzir a inflamação induzida por príons
Summary
As células estromais mesenquimais derivadas do tecido adiposo (AdMSCs) têm propriedades imunomoduladoras potentes, úteis para o tratamento de doenças associadas à inflamação. Demonstramos como isolar e cultivar AdMSCs murinas e glia mista primária, estimular AdMSCs para regular positivamente genes anti-inflamatórios e fatores de crescimento, avaliar a migração de AdMSCs e co-cultivar AdMSCs com glia primária mista infectada por príons.
Abstract
As células estromais mesenquimais (MSCs) são potentes reguladores da inflamação por meio da produção de citocinas anti-inflamatórias, quimiocinas e fatores de crescimento. Essas células mostram uma capacidade de regular a neuroinflamação no contexto de doenças neurodegenerativas, como a doença do príon e outros distúrbios de desdobramento de proteínas. As doenças priônicas podem ser esporádicas, adquiridas ou genéticas; Eles podem resultar do desdobramento e agregação da proteína príon no cérebro. Essas doenças são invariavelmente fatais, sem tratamentos disponíveis.
Um dos primeiros sinais da doença é a ativação de astrócitos e microglia e inflamação associada, que ocorre antes da agregação de príons detectável e perda neuronal; assim, as propriedades anti-inflamatórias e regulatórias das MSCs podem ser colhidas para tratar a astrogliose na doença do príon. Recentemente, mostramos que as MSCs derivadas do tecido adiposo (AdMSCs) co-cultivadas com células BV2 ou glia mista primária reduzem a inflamação induzida por príons por meio da sinalização parácrina. Este artigo descreve um tratamento confiável usando AdMSCs estimuladas para diminuir a inflamação induzida por príons.
Uma população heterozigótica de AdMSCs pode ser facilmente isolada do tecido adiposo murino e expandida em cultura. Estimular essas células com citocinas inflamatórias aumenta sua capacidade de migrar para o homogeneizado cerebral infectado por príons e produzir moduladores anti-inflamatórios em resposta. Juntas, essas técnicas podem ser usadas para investigar o potencial terapêutico das MSCs na infecção por príons e podem ser adaptadas para outras doenças neuroinflamatórias e de desdobramento de proteínas.
Introduction
A inflamação glial desempenha um papel fundamental em uma variedade de doenças neurodegenerativas, incluindo Parkinson, Alzheimer e doença do príon. Embora a agregação anormal de proteínas seja atribuída a grande parte da patogênese da doença e da neurodegeneração, as células gliais também desempenham um papel na exacerbação disso 1,2,3. Portanto, direcionar a inflamação induzida pela glia é uma abordagem terapêutica promissora. Na doença do príon, a proteína príon celular (PrPC) se dobra incorretamente para a proteína príon associada à doença (PrPSc), que forma oligômeros e agregados e interrompe a homeostase no cérebro 4,5,6.
Um dos primeiros sinais da doença do príon é uma resposta inflamatória de astrócitos e micróglia. Estudos que suprimem essa resposta, seja pela remoção da microglia ou modificação dos astrócitos, geralmente não mostraram melhora ou piora da patogênese da doença em modelos animais 7,8,9. Modular a inflamação glial sem eliminá-la é uma alternativa intrigante como terapêutica.
As células estromais mesenquimais (CTMs) têm entrado em cena como tratamento para uma variedade de doenças inflamatórias, devido à sua capacidade de modular a inflamação de forma parácrina 10,11. Eles mostraram a capacidade de migrar para locais de inflamação e responder a moléculas de sinalização nesses ambientes, secretando moléculas anti-inflamatórias, fatores de crescimento, microRNAs e muito mais 10,12,13. Demonstramos anteriormente que as MSCs derivadas do tecido adiposo (denotadas AdMSCs) são capazes de migrar para o homogeneizado cerebral infectado por príons e responder a esse homogeneizado cerebral regulando positivamente a expressão gênica de citocinas anti-inflamatórias e fatores de crescimento.
Além disso, as AdMSCs podem diminuir a expressão de genes associados ao Fator Nuclear-kappa B (NF-κB), o domínio de pirina da família Nod-Like Receptor contendo sinalização de inflamassoma 3 (NLRP3) e ativação glial, tanto na microglia BV2 quanto na glia mista primária 14. Aqui, fornecemos protocolos sobre como isolar AdMSCs e glia mista primária de camundongos, estimular AdMSCs para regular positivamente genes moduladores, avaliar a migração de AdMSC e co-cultivar AdMSCs com glia infectada por príons. Esperamos que esses procedimentos possam fornecer uma base para uma investigação mais aprofundada do papel das MSCs na regulação da inflamação induzida pela glia em doenças neurodegenerativas e outras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, demonstramos um protocolo confiável e relativamente barato para avaliar os efeitos das células estromais mesenquimais derivadas do tecido adiposo (AdMSCs) na diminuição da inflamação induzida por príons em um modelo de células gliais. As AdMSCs podem ser facilmente isoladas e expandidas em cultura para uso em menos de 1 semana. Este protocolo produz consistentemente uma população heteróloga de células que expressam marcadores consistentes com os das células estromais mesenquimais por imunofluorescênci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem à Lab Animal Resources por sua criação de animais. Nossas fontes de financiamento para este manuscrito incluem o Fundo Boettcher, o Fundo Murphy Turner, a Faculdade de Medicina Veterinária da CSU e o Conselho de Pesquisa da Faculdade de Ciências Biomédicas. A Figura 2A, a Figura 2C e a Figura 3A foram criadas com BioRender.com.
Materials
| 0.25% Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| 5 mL serological pipets | Celltreat | 229005B | |
| 6-well tissue culture plates | Celltreat | 229106 | |
| 10 cm cell culture dishes | Peak Serum | PS-4002 | |
| 10 ml serological pipets | Celltreat | 229210 | |
| 15 mL conical tubes | Celltreat | 667015B | |
| 50 mL conical tubes | Celltreat | 667050B | |
| BV2 microglia cell line | AcceGen Biotech | ABC-TC212S | |
| Cell lifter | Biologix Research Company | 70-2180 | |
| Crystal violet | Electron Microscopy Sciences | 12785 | |
| Dispase | Thermo Scientific | 17105041 | |
| DMEM/F12 | Caisson Labs | DFL14-500ML | |
| DNase-I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| Essential amino acids | Thermo Scientific | 11130051 | |
| Ethanol (100%) | EMD Millipore | EX0276-1 | |
| Fetal bovine serum (heat inactivated) | Peak Serum | PS-FB4 | Can be purchased as heat inactivated or inactivated in the laboratory |
| Formaldehyde | EMD Millipore | 1.04003.1000 | |
| Glass 10 mL serological pipet | Corning | 7077-10N | |
| Hank’s Balances Salt Solution | Sigma Aldrich | H8264-500ML | |
| Hemocytometer/Neubauer Chamber | Daigger | HU-3100 | |
| High Glucose DMEM | Cytiva | SH30022.01 | |
| low glucose DMEM containing L-glutamine | Cytiva | SH30021.01 | |
| MEM/EBSS | Cytiva | SH30024.FS | |
| non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145-100M | |
| Paraformaldehyde (16%) | MP Biomedicals | 219998320 | |
| Penicillin/streptomycin/neomycin | Sigma-Aldrich | P4083-100ML | |
| Phosphate buffered saline | Cytiva | SH30256.01 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D Systems | 485-MI | |
| Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CF | R&D Systems | 410-MT | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Coat inside of glass pipets by aspirating up and down twice in Sigmacote and allowing to dry thoroughly. Wrap in aluminum foil and autoclave pipets 24 h later. |
| Stemxyme | Worthington Biochemical Corporation | LS004106 | Collagenase/Dispase mixture |
| Sterile, individually wrapped cotton swab | Puritan Medical | 25-8061WC | |
| Thincert Tissue Culture Inserts, 24 well, Pore Size=8 µm | Greiner Bio-One | 662638 | |
| Thincert Tissue Culture Inserts, 6 well, Pore Size=0.4 µm | Greiner Bio-One | 657641 |
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