Prion Kaynaklı Enflamasyonu Azaltmak için Primer Karışık Glia ile Ko-Kültürlenmiş Adipoz Kaynaklı Mezenkimal Stromal Hücreler
Summary
Adipoz kaynaklı mezenkimal stromal hücreler (AdMSC’ler), inflamasyonla ilişkili hastalıkların tedavisinde yararlı olan güçlü immünomodülatör özelliklere sahiptir. Murin AdMSC’lerin ve primer karışık gliaların nasıl izole edileceğini ve kültürleneceğini, AdMSC’lerin anti-inflamatuar genleri ve büyüme faktörlerini yukarı regüle etmek için nasıl uyarılacağını, AdMSC’lerin göçünün nasıl değerlendirileceğini ve AdMSC’lerin primer karışık prion ile enfekte glia ile nasıl ko-kültür yapılacağını gösteriyoruz.
Abstract
Mezenkimal stromal hücreler (MSC’ler), anti-inflamatuar sitokinler, kemokinler ve büyüme faktörlerinin üretimi yoluyla inflamasyonun güçlü düzenleyicileridir. Bu hücreler, prion hastalığı ve diğer protein yanlış katlanma bozuklukları gibi nörodejeneratif hastalıklar bağlamında nöroinflamasyonu düzenleme yeteneği gösterir. Prion hastalıkları sporadik, edinsel veya genetik olabilir; Beyindeki prion proteininin yanlış katlanması ve toplanmasından kaynaklanabilirler. Bu hastalıklar her zaman ölümcüldür ve mevcut bir tedavisi yoktur.
Hastalığın en erken belirtilerinden biri, astrositlerin ve mikrogliaların aktivasyonu ve saptanabilir prion agregasyonu ve nöronal kayıptan önce ortaya çıkan ilişkili inflamasyondur; bu nedenle, MSC’lerin anti-enflamatuar ve düzenleyici özellikleri, prion hastalığında astrogliozu tedavi etmek için hasat edilebilir. Son zamanlarda, BV2 hücreleri veya primer karışık glia ile birlikte kültürlenen adipoz kaynaklı MSC’lerin (AdMSC’ler) parakrin sinyalleme yoluyla prion kaynaklı inflamasyonu azalttığını gösterdik. Bu makale, prion kaynaklı inflamasyonu azaltmak için uyarılmış AdMSC’leri kullanan güvenilir bir tedaviyi açıklamaktadır.
Heterozigot bir AdMSC popülasyonu, murin yağ dokusundan kolayca izole edilebilir ve kültürde genişletilebilir. Bu hücrelerin inflamatuar sitokinlerle uyarılması, hem prion ile enfekte beyin homojenatına doğru göç etme hem de yanıt olarak anti-inflamatuar modülatörler üretme yeteneklerini arttırır. Birlikte, bu teknikler MSC’lerin prion enfeksiyonu üzerindeki terapötik potansiyelini araştırmak için kullanılabilir ve diğer protein yanlış katlanması ve nöroinflamatuar hastalıklar için uyarlanabilir.
Introduction
Glial inflamasyon, Parkinson, Alzheimer ve prion hastalığı dahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda önemli bir rol oynar. Anormal protein agregasyonu, hastalık patogenezi ve nörodejenerasyonun çoğuna atfedilse de, glial hücreler de bu 1,2,3’ün şiddetlenmesinde rol oynar. Bu nedenle, glial kaynaklı inflamasyonu hedeflemek umut verici bir terapötik yaklaşımdır. Prion hastalığında, hücresel prion proteini (PrPC), oligomerleri oluşturan ve beyinde agregat oluşturan ve homeostazı bozan hastalıkla ilişkili prion proteinine (PrPSc) yanlış katlanır 4,5,6.
Prion hastalığının en erken belirtilerinden biri, astrositler ve mikrogliadan kaynaklanan inflamatuar bir yanıttır. Mikroglia’nın uzaklaştırılması veya astrositlerin modifikasyonu yoluyla bu yanıtı baskılayan çalışmalar, genellikle hayvan modellerinde hastalık patogenezinde herhangi bir iyileşme göstermemiş veya kötüleşmiştir 7,8,9. Glial inflamasyonu ortadan kaldırmadan modüle etmek, terapötik olarak ilgi çekici bir alternatiftir.
Mezenkimal stromal hücreler (MSC’ler), iltihabı parakrin bir şekilde modüle etme yetenekleri nedeniyle çeşitli enflamatuar hastalıkların tedavisi için bir tedavi olarak sahne almıştır 10,11. Anti-enflamatuar moleküller, büyüme faktörleri, mikroRNA’lar ve daha fazlasını salgılayarak iltihaplanma bölgelerine göç etme ve bu ortamlardaki sinyal moleküllerine yanıt verme yeteneğini göstermişlerdir 10,12,13. Daha önce, yağ dokusundan türetilen MSC’lerin (AdMSC’ler olarak adlandırılır) prion ile enfekte olmuş beyin homojenatına doğru göç edebildiğini ve anti-inflamatuar sitokinler ve büyüme faktörleri için gen ekspresyonunu yukarı regüle ederek bu beyin homojenatına yanıt verebildiğini göstermiştik.
Ayrıca, AdMSC’ler, hem BV2 mikrogliasında hem de birincil karışık glia 14’te 3 (NLRP3) inflamatuar sinyalleme içeren Nod Benzeri Reseptör ailesi pirin alanı ve glial aktivasyon olan Nükleer Faktör-kappa B (NF-κB) ile ilişkili genlerin ekspresyonunu azaltabilir. Burada, hem AdMSC’lerin hem de birincil karışık glia’nın farelerden nasıl izole edileceğine, AdMSC’lerin modülatör genleri yukarı regüle etmek için nasıl uyarılacağına, AdMSC göçünün nasıl değerlendirileceğine ve AdMSC’lerin prion ile enfekte glia ile nasıl birlikte kültürleneceğine ilişkin protokoller sunuyoruz. Bu prosedürlerin, nörodejeneratif ve diğer hastalıklarda glial kaynaklı inflamasyonu düzenlemede MSC’lerin rolünün daha fazla araştırılması için bir temel sağlayabileceğini umuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, bir glial hücre modelinde prion kaynaklı inflamasyonu azaltmada adipoz kaynaklı mezenkimal stromal hücrelerin (AdMSC’ler) etkilerini değerlendirmek için güvenilir ve nispeten ucuz bir protokol gösteriyoruz. AdMSC’ler, 1 hafta gibi kısa bir sürede kullanım için kültürde kolayca izole edilebilir ve genişletilebilir. Bu protokol tutarlı bir şekilde, immünofloresan ve akış sitometrisi ile mezenkimal stromal hücrelerinkiyle tutarlı belirteçleri eksprese eden ve sitokinlere veya prion ile enfekte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, hayvancılıkları için Lab Animal Resources’a teşekkür ediyor. Bu el yazması için finansman kaynaklarımız arasında Boettcher Fonu, Murphy Turner Fonu, CSU Veterinerlik Fakültesi ve Biyomedikal Bilimler Koleji Araştırma Konseyi bulunmaktadır. Şekil 2A, Şekil 2C ve Şekil 3A , BioRender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| 0.25% Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| 5 mL serological pipets | Celltreat | 229005B | |
| 6-well tissue culture plates | Celltreat | 229106 | |
| 10 cm cell culture dishes | Peak Serum | PS-4002 | |
| 10 ml serological pipets | Celltreat | 229210 | |
| 15 mL conical tubes | Celltreat | 667015B | |
| 50 mL conical tubes | Celltreat | 667050B | |
| BV2 microglia cell line | AcceGen Biotech | ABC-TC212S | |
| Cell lifter | Biologix Research Company | 70-2180 | |
| Crystal violet | Electron Microscopy Sciences | 12785 | |
| Dispase | Thermo Scientific | 17105041 | |
| DMEM/F12 | Caisson Labs | DFL14-500ML | |
| DNase-I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| Essential amino acids | Thermo Scientific | 11130051 | |
| Ethanol (100%) | EMD Millipore | EX0276-1 | |
| Fetal bovine serum (heat inactivated) | Peak Serum | PS-FB4 | Can be purchased as heat inactivated or inactivated in the laboratory |
| Formaldehyde | EMD Millipore | 1.04003.1000 | |
| Glass 10 mL serological pipet | Corning | 7077-10N | |
| Hank’s Balances Salt Solution | Sigma Aldrich | H8264-500ML | |
| Hemocytometer/Neubauer Chamber | Daigger | HU-3100 | |
| High Glucose DMEM | Cytiva | SH30022.01 | |
| low glucose DMEM containing L-glutamine | Cytiva | SH30021.01 | |
| MEM/EBSS | Cytiva | SH30024.FS | |
| non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145-100M | |
| Paraformaldehyde (16%) | MP Biomedicals | 219998320 | |
| Penicillin/streptomycin/neomycin | Sigma-Aldrich | P4083-100ML | |
| Phosphate buffered saline | Cytiva | SH30256.01 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D Systems | 485-MI | |
| Recombinant Mouse TNF-alpha (aa 80-235) Protein, CF | R&D Systems | 410-MT | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2-100ML | Coat inside of glass pipets by aspirating up and down twice in Sigmacote and allowing to dry thoroughly. Wrap in aluminum foil and autoclave pipets 24 h later. |
| Stemxyme | Worthington Biochemical Corporation | LS004106 | Collagenase/Dispase mixture |
| Sterile, individually wrapped cotton swab | Puritan Medical | 25-8061WC | |
| Thincert Tissue Culture Inserts, 24 well, Pore Size=8 µm | Greiner Bio-One | 662638 | |
| Thincert Tissue Culture Inserts, 6 well, Pore Size=0.4 µm | Greiner Bio-One | 657641 |
References
- Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541 (7638), 481-487 (2017).
- Smith, H. L., et al. Astrocyte unfolded protein response induces a specific reactivity state that causes non-cell-autonomous neuronal degeneration. Neuron. 105 (5), 855-866 (2020).
- Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
- Collinge, J., Clarke, A. R. A general model of prion strains and their pathogenicity. Science. 318 (5852), 930-936 (2007).
- Gajdusek, D. C. Transmissible and non-transmissible amyloidoses: autocatalytic post-translational conversion of host precursor proteins to beta-pleated sheet configurations. J Neuroimmunol. 20 (2-3), 95-110 (1988).
- Come, J. H., Fraser, P. E., Lansbury, P. T. A kinetic model for amyloid formation in the prion diseases: importance of seeding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (13), 5959-5963 (1993).
- Hartmann, K., et al. Complement 3(+)-astrocytes are highly abundant in prion diseases, but their abolishment led to an accelerated disease course and early dysregulation of microglia. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 83 (2019).
- Carroll, J. A., Race, B., Williams, K., Striebel, J., Chesebro, B. Microglia are critical in host defense against prion disease. Journal of Virology. 92 (15), e00549 (2018).
- Bradford, B. M., McGuire, L. I., Hume, D. A., Pridans, C., Mabbott, N. A. Microglia deficiency accelerates prion disease but does not enhance prion accumulation in the brain. Glia. 70 (11), 2169-2187 (2022).
- Li, M., Chen, H., Zhu, M. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine in central nervous system. Frontiers in Neuroscience. 16, 1068114 (2022).
- Sanchez-Castillo, A. I., et al. Switching roles: beneficial effects of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells on microglia and their implication in neurodegenerative diseases. Biomolecules. 12 (2), 219 (2022).
- Fu, X., et al. Mesenchymal stem cell migration and tissue repair. Cells. 8 (8), 784 (2019).
- Xiao, Q., et al. TNF-alpha increases bone marrow mesenchymal stem cell migration to ischemic tissues. Cell Biochemistry and Biophysics. 62 (3), 409-414 (2012).
- Hay, A. J. D., Murphy, T. J., Popichak, K. A., Zabel, M. D., Moreno, J. A. Adipose-derived mesenchymal stromal cells decrease prion-induced glial inflammation in vitro. Scientific Reports. 12 (1), 22567 (2022).
- Kirkley, K. S., Popichak, K. A., Afzali, M. F., Legare, M. E., Tjalkens, R. B. Microglia amplify inflammatory activation of astrocytes in manganese neurotoxicity. Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 99 (2017).
- Popichak, K. A., Afzali, M. F., Kirkley, K. S., Tjalkens, R. B. Glial-neuronal signaling mechanisms underlying the neuroinflammatory effects of manganese. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 324 (2018).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Hass, R., Otte, A. Mesenchymal stem cells as all-round supporters in a normal and neoplastic microenvironment. Cell Communication and Signaling: CCS. 10 (1), 26 (2012).
- Carroll, J. A., et al. Prion strain differences in accumulation of PrPSc on neurons and glia are associated with similar expression profiles of neuroinflammatory genes: comparison of three prion strains. PLoS Pathogens. 12 (4), 1005551 (2016).
- Carroll, J. A., Race, B., Williams, K., Chesebro, B. Toll-like receptor 2 confers partial neuroprotection during prion disease. PLoS One. 13 (12), e0208559 (2018).
- Yu, Y., et al. Hypoxia and low-dose inflammatory stimulus synergistically enhance bone marrow mesenchymal stem cell migration. Cell Proliferation. 50 (1), e12309 (2017).
- Hay, A. J. D., et al. Intranasally delivered mesenchymal stromal cells decrease glial inflammation early in prion disease. Frontiers in Neuroscience. 17, 1158408 (2023).
- English, K., Barry, F. P., Field-Corbett, C. P., Mahon, B. P. IFN-gamma and TNF-alpha differentially regulate immunomodulation by murine mesenchymal stem cells. Immunology Letters. 110 (2), 91-100 (2007).
- Hemeda, H., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha differentially affect cytokine expression and migration properties of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 19 (5), 693-706 (2010).
- Carta, M., Aguzzi, A. Molecular foundations of prion strain diversity. Current Opinion in Neurobiology. 72, 22-31 (2022).
- Yu, F., et al. Phagocytic microglia and macrophages in brain injury and repair. CNS Neuroscience and Therapeutics. 28 (9), 1279-1293 (2022).
- Sinha, A., et al. Phagocytic activities of reactive microglia and astrocytes associated with prion diseases are dysregulated in opposite directions. Cells. 10 (7), 1728 (2021).
- Stansley, B., Post, J., Hensley, K. A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer’s disease. Journal of Neuroinflammation. 9, 115 (2012).
- Shan, Z., et al. Therapeutic effect of autologous compact bone-derived mesenchymal stem cell transplantation on prion disease. Journal of General Virology. 98 (10), 2615-2627 (2017).
- Johnson, T. E., et al. Monitoring immune cells trafficking fluorescent prion rods hours after intraperitoneal infection. Journal of Visualized Experiments. (45), e2349 (2010).
- Liu, F., et al. MSC-secreted TGF-beta regulates lipopolysaccharide-stimulated macrophage M2-like polarization via the Akt/FoxO1 pathway. Stem Cell Research and Therapy. 10, 345 (2019).
