In Vitro Gelişimsel Mekanobiyolojiyi İncelemek için Çip Üzerinde Fetal İnsan Gemisi Modeli

NOT: Tüm hücre kültürü teknikleri steril koşullar altında laminer akış başlığında yapılmalı ve hücreler 37 °C’de O2 içeren humifiye bir atmosferde inkübe edilmelidir. Hem idame (rhbFGF) hem de farklılaşma protokolü (rhBMP4, rhVEGF, rhbFGF, rhIL6, rhFLT3L, rhIGF1, rhIL11, rhSCF, rhEPO, rhTPO, rhIL3) için tüm sitokin preparatları için talimatlar Ek Tablo S1’dedir. 1. hiPSC’lerin kültürlenmesi – hücrelerin çözülmesi, bakımı ve dondurulması Bakım ortamının, büyüme faktörlerinin ve diğer reaktiflerin hazırlanmasıDulbecco’nun Modifiye Eagle Medium/F12 (DMEM/F-12) bazal ortamına tüm hESC’lerin serumsuz ortam takviyesi, 36 mL sığır serum albümini (BSA) ve 1 mL 55 mM β-merkaptoetanol ekleyerek kültür ortamını hazırlayın (bkz. 1 mg Rho Kinaz inhibitörünü (iRock) 1 mL DMSO içinde yeniden süspanse edin, 50 μL’lik alikotlar yapın ve bunları -20 ° C’de saklayın.NOT: Bu alikotlar -20 °C’de 1 yıl saklanabilir. Çözüldükten sonra 4 °C’de 1 hafta bekletilebilir. Vitronektin (VTN-N) çözeltisini buz üzerinde çözdürün ve -80 ° C’de saklamadan önce flakon başına 60 μL alikotlayın. Plakaları kaplamadan hemen önce, 60 μL’lik stoğu 6 mL Dulbecco’nun fosfat tamponlu salininde (DPBS) seyreltin; 5 μg/mL’lik son konsantrasyon. hiPSC hücre hattı çözülmesiNOT: İnsan pluripotent kök hücre hattı SFCi55 daha önce şirket içinde türetilmiştir ve çeşitli hücre tiplerine ve farklı embriyonik soylarafarklılaşma için yaygın olarak kullanılmıştır 19,20,21,22.37 ° C’de 1 saat boyunca 1 mL VTN-N çözeltisi ile 6 oyuklu bir plakanın bir kuyusunu kaplayın.NOT: İnkübasyondan sonra, kaplanmış plakalar 4 °C’de 1 haftaya kadar saklanabilir. VTN-N çözeltisini bir aspirasyon pipeti ile aspire edin ve 20 ng/mL rhbFGF ile desteklenmiş 1 mL önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin (Ek Tablo S1). Bir su banyosunda hiPSC’leri içeren şişenin buzunu hızla çözün ve hücreyi 5 mL önceden ısıtılmış kültür ortamına aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında 300 × g’da 3 dakika döndürün. Hücre peletini 20 ng/mL rhbFGF ile takviye edilmiş 0.5 mL kültür ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri, zaten 1 mL ortam içeren kaplanmış bir kuyucuğa aktarın. Toplam 1,5 mL besiyerinde hücreleri içeren kuyucuklara 5 μL iRock ekleyin. Hücreleri inkübatörde kültürleyin, hafta boyunca günlük olarak ortamı değiştirin ve hafta sonu beslenmeyi sağlamak için hücrelere normal hacmin iki katı ortam ekleyerek hücreleri iki kez besleyin.NOT: Hücreler iRock varlığında yalnızca 24 saat büyütülür. hiPSC’lerin bakımı ve geçirilmesiOrtamı günlük olarak 20 ng / mL rhbFGF ile desteklenmiş taze önceden ısıtılmış kültür ortamı ile değiştirin. Hücreleri, genellikle haftada iki kez, yaklaşık% 80 birleşmeye ulaştıklarında geçirin.Hücreleri geçmek için, daha önce 1.2.1 ve 1.2.2 adımlarında açıklandığı gibi bir plakayı VTN-N ile kaplayın. Ortamı kuyulardan hücrelerle aspire edin ve DPBS ile yıkayın. DPBS’yi aspire edin ve 1 mL ayrışma reaktifi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 1 dakika inkübe edin. Ayrışma reaktifini aspire edin ve 3 dakika daha inkübe edin. Plakaya her iki taraftan 10 kez sıkıca vurun.NOT: Ayrışma adımı, inkübasyon süresinde ve kılavuz çekme prosedüründe hücre tipine özel optimizasyona ihtiyaç duyabilir. Hücrelere 1 mL kültür ortamı ekleyin ve bir Pasteur pipeti ile kolonilerin çoğunun toplanmasını sağlamak için ortamla bir kez yıkayın. 6’ya 1 kuyucuklu bir geçiş oranı sağlamak için her bir oyuğa 150 μL hücre süspansiyonu ekleyin.NOT: Yeni bir şişenin çözülmesinden hemen sonra, hücrelerin 1: 6 oranında geçmeden önce sabit bir büyüme aşamasına ulaşmalarını sağlamak için bir veya iki geçiş için 1: 1 veya 1: 2 gibi daha düşük bir oranda geçmek daha iyidir. İnkübatördeki hücreleri kültürleyin, ortamı hafta boyunca günlük olarak değiştirin ve hücreleri hafta sonu bir kez iki kez besleyin. hiPSC’ler hücre hattı donuyorNOT: Kültürü başlatmak için sabit bir düşük geçişli donmuş şişe partisinin korunmasını sağlamak için çözdürüldükten sonra hücreleri ilk iki geçişlerinde dondurun. Yaklaşık% 80’lik bir birleşmeye ulaştıklarında hücreleri dondurun.Ortamı 20 ng/mL rhbFGF ve 5 μL iRock ile desteklenmiş taze önceden ısıtılmış kültür ortamına değiştirin ve en az 1 saat inkübe edin. Hücreleri 1.3.2.2-1.3.2.5 adımlarında açıklandığı gibi ayırın. Ayrılan hücreleri, 5 mL kültür ortamı içeren 15 mL’lik bir santrifüj tüpünde toplayın. Oda sıcaklığında 300 × g’da 3 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve 1 mL kriyoprezervasyon solüsyonu ekleyin (bkz. Bir Pasteur pipeti kullanarak, kriyoprezervasyon solüsyonunda karıştırmak için hücreleri nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin.NOT: Hücre kümelerinin ayrışmasına neden olabilecek aşırı pipetlemeden kaçının. Hücre süspansiyonunu her biri 0,5 mL’lik iki kriyoprezervasyon şişesine bölün. Kriyoprezervasyon şişelerini 4 °C’de önceden soğutulmuş bir kriyoprezervasyon kabına aktarın. Şişeleri uzun süreli saklama için sıvı nitrojene aktarmadan önce hücrelerle birlikte kabı 24 saat boyunca -80 °C’lik bir dondurucuya aktarın. 2. HiPSC’lerin endotel hücrelerine farklılaşması Farklılaşma ortamı, sitokinler ve büyüme faktörlerinin hazırlanmasıTablo 1’e göre serumsuz farklılaşma ortamı (SFD) hazırlayın. Bu ortamı 0. günden 5. güne kadar kullanın. 34 SFM Bazal Ortama 34 besin takviyesi ve 5 mL L-glutamin takviyesi ekleyerek CD34+ hücreleri (SFM-34) için serumsuz ortam hazırlayın (bkz. Bu ortamı, farklılaşmanın 6. gününden itibaren kullanın. 3 mM’lik bir çözelti elde etmek için 716 μL DMSO’da 1 mg CHIR99021 yeniden süspanse edin. Tamamen yeniden süspanse olana kadar oda sıcaklığında inkübe edin; gerekirse 37 °C’de hızlı bir şekilde ısıtın. 20 μL’lik alikotlar yapın ve -20 °C’de 6 aya kadar saklayın. Çözdürdükten hemen sonra kullanın ve tekrar dondurmayın veya saklamayın. Sitokinleri Ek Tablo S1’deki talimatlara göre yeniden süspanse edin. Tüm sitokinlerin alikotlarını -80 °C’de saklayın. Endotel hücrelerinin farklılaşmasıNOT: Farklılaşmanın her günü için, 18 mL (3 mL ortam/kuyu) önceden ısıtılmış SFD ortamı, aşağıda açıklanan sitokinlerin karışımlarına göre hazırlayın. Tablo 2.0. Gün – embriyoid cisimciklerinin (EB’ler) oluşumuHer 6 oyuklu plaka (3 mL / kuyucuk) için Tablo 2’ye göre 1 sitokin ile 18 mL SFD ortamı hazırlayın. Hücre itici 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 1 sitokin karıştırarak 2 mL önceden ısıtılmış SFD ortamı ekleyin (bkz. EB’leri oluşturmak için 1.3.2.2-1.3.2.4 adımlarında açıklanan adımları izleyin.NOT: Farklılaşmayı başlatmak için hiPSC’lerin -80 oranında birleştiğinden emin olun. Ayrılmış hücre kümelerinin her bir kuyucuğuna 1 sitokin karıştırarak 1 mL önceden ısıtılmış SFD ortamı ekleyin. Hücre kümelerini 1:1 oranında EB oluşumu için tek bir hücre itici kuyuya nazikçe aktarmak için bir Pasteur pipeti kullanın. Plakayı inkübatöre yerleştirdikten sonra, EB’leri kuyuya eşit şekilde dağıtmak için ileri ve geri, sağa ve sola hareket ettirin. 1. Gün – EB’lerde orta düzeyde değişiklikNOT: Bu adım yalnızca, farklılaşmanın 1. gününe kadar, EB’lerin yanında süspansiyonda çok sayıda tek hücre varsa gereklidir.Her 6 oyuklu plaka (3 mL / kuyucuk) için Tablo 2’ye göre 1 sitokin ile 18 mL SFD ortamı hazırlayın. Plakayı EB’lerle döndürerek merkeze taşıyın ve bir Pasteur pipeti kullanarak 15 mL’lik bir santrifüj tüpüne toplayın.NOT: EB’ler dizilerde olduğu gibi kümelenmiş görünüyorsa, 1000 mL’lik santrifüj tüpüne toplamadan önce bir P15 ile yukarı ve aşağı pipetleyerek ayırın. EB’lerin tüpün dibine yerleşmesi için 5-10 dakika bekleyin.NOT: EB’ler çok küçükse, yerleşmelerine yardımcı olmak için 100 × g’da 5 dakika santrifüj edin. Tek hücreleri veya kalıntıları temizlemek için hücre itici plakaları steril su veya DPBS ile yıkayın. Süpernatanı EB’lerden yerinden çıkarmadan dikkatlice ve yavaşça aspire edin. Hücre itici plakaların her bir oyuğuna Mix 1 sitokin ile 2 mL SFD ekleyin. Her başlangıç kuyucuğu için 1 sitokin karışımı ile 1 mL SFD ortamı kullanarak EB’leri yeniden süspanse edin – 6 oyuklu bir plaka için 6 mL ortam ekleyin. EB’leri, zaten 2 mL SFD ortamı içeren oyuk başına 1 mL hacimde hücre itici plakalara aktarın. Plakayı inkübatöre yerleştirdikten sonra, EB’leri kuyuya eşit şekilde dağıtmak için ileri ve geri, sağa ve sola hareket ettirin. 2. Gün – CHIR99021 eklenmesiEB’leri plakanın ortasına döndürün ve hücrelerle doğrudan temastan kaçınmak için kuyunun yan tarafına Tablo 2’ye göre CHIR99021 ekleyin.NOT: Ortam 1. günde değiştirilmediyse, yalnızca CHIR eklemek yerine tüm ortamı değiştirin. Her 6 oyuklu plaka (3 mL/kuyucuk) için Tablo 2’ye göre Karışım 2 ile 18 mL SFD ortamı hazırlayın. Plakayı inkübatöre yerleştirdikten sonra, EB’leri kuyuya eşit şekilde dağıtmak için ileri ve geri, sağa ve sola hareket ettirin. 3. Gün – EB’lerde orta değişim ve Mix 3 sitokinlerinin eklenmesiHer 6 oyuklu plaka (3 mL / kuyucuk) için Tablo 2’ye göre 3 sitokin karıştırın ile 18 mL SFD ortamı hazırlayın. EB’leri 2.2.2.2-2.2.2.4 adımlarında açıklandığı gibi toplayın. Hücre itici plakalara 3 sitokin karışımı ile önceden ısıtılmış 2 mL SFD ortamı ekleyin. Süpernatanı EB’lerden dikkatlice aspire edin. Mix 3 sitokin ile 1 mL / kuyu SFD ekleyin. EB’leri 2.2.2.8-2.2.2.9 adımlarında açıklandığı gibi kuyular arasında dağıtın. 6. Gün – SFM-34 için orta değişim ve Mix 4 sitokinlerinin eklenmesiHer 6 oyuklu plaka (3 mL / kuyucuk) için Tablo 2’ye göre 4 sitokin karıştırın ile 18 mL SFD ortamı hazırlayın. EB’leri 2.2.2.2-2.2.2.4 adımlarında açıklandığı gibi toplayın. Hücre itici plakalara 2 mL önceden ısıtılmış SFM-34 ortamı Mix 4 sitokin ekleyin. Süpernatanı EB’lerden dikkatlice aspire edin. Mix 4 sitokinleri ile 1 mL / kuyu SFM-34 ekleyin. EB’leri 2.2.2.8-2.2.2.9 adımlarında açıklandığı gibi kuyular arasında dağıtın. 3. CD34 + hücre izolasyonu ve çipe tohumlama NOT: CD34+ hücreleri, monoklonal fare antikorları, anti-insan CD34 antikorları ve FcR Bloke edici reaktife (İnsan IgG) konjuge CD34 mikroboncukları içeren bir CD34 mikroboncuk kiti (Malzeme Tablosuna bakınız) ile pozitif bir izolasyon yaklaşımı ile izole edilir. Akış sitometrisi analizi için izolasyondan önce ve sonra hücreleri boyayarak kolon izolasyonunun verimliliğini doğrulamak önemlidir, Aşağıda bu analiz için hücrelerin ne zaman alınması gerektiği belirtilmiştir. Malzemeleri ve reaktifleri hazırlayın.PBS +% 0.5 BSA + 2 mM EDTA elde etmek için 5 mL %5 BSA çözeltisi ve 200 μL EDTA 0.5 M ila 45 mL DPBS ekleyerek yıkama tamponu hazırlayın. Her izolasyon için taze hazırlayın, filtreyle sterilize edin ve kullanıma kadar buzdolabında saklayın. Akışkan cipsleri, rhLaminin 521 1:50’nin DPBS Ca 2+ Mg2+ içinde seyreltilmesiyle hazırlanan laminin çözeltisi ile kaplayın. Her bir çipi, kullanılan çip için uygun hacimle kaplayın ve tohumlamadan önce 2 saat inkübatörde inkübe edin.NOT: Kaplama için başka matrisler kullanılabilir ve spesifik hücre tipi/deney için test edilmelidir. Tablo 2’ye göre 18 mL SFM-34 ortamını Mix 4 sitokin ile destekleyerek Mix 4 SFM-34 besiyerini hazırlayın ve karışımı, gaz değişimini kolaylaştırmak için kapağı hafifçe çevrilmemiş olarak inkübatörde 50 mL’lik bir tüpe yerleştirin. Seçilen perfüzyon setlerini ve inkübatörde kullanılacak diğer boruları gazdan arındırmak için yerleştirin. 8. Gün – EB’lerin ayrışması ve CD34+ izolasyonuEB’leri 2.2.2.2-2.2.2.5 adımlarında açıklandığı gibi toplayın. Toplanan EB’lerin başlangıç kuyucuğu başına 1 mL hücre ayrışma reaktifi ekleyin (6 kuyucuk toplanmışsa, 6 mL ekleyin). Hücre ayrışma reaktifindeki EB süspansiyonunun 1 mL’sini hücre itici plakanın her bir oyuğuna geri aktarın. Kuluçka makinesinde 10 dakika inkübe edin. EB’leri bir P1000 ile en fazla 10 kez olmak üzere kuyuya doğru yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin. 3.2.4-3.2.5. adımlarını toplam 3x için tekrarlayın.NOT: EB’lerin ayrışması zorsa, yukarıdaki adımları toplamda 4 kez tekrarlayın. Ayrışmış EB’lerin her bir oyuğu için 5 mL yıkama tamponu ekleyin. Hücreleri 40 μm’lik bir süzgeçten geçirerek 50 mL’lik bir santrifüj tüpüne toplayın. Hücreleri saymak için 10 μL hücre süspansiyonu alın.NOT: İzolasyonun etkinliğini test etmek için, 105 hücreyi/tüpü, daha sonra akış sitometrisi için kullanılacak iki farklı tüpe (boyanmamış kontrol ve önceden sıralanmış test numunesi) aktarın (4.3.9-4.3.13 adımlarında açıklandığı gibi). 6 oyuklu bir plaka için, filtrasyondan sonra ~ 106 hücre toplanmalıdır. Hücreleri 300 × g’da 10 dakika döndürün. Hücreleri 300 μL yıkama tamponunda yeniden süspanse edin, topak olmadığından emin olmak için birkaç kez hafifçe pipetleyin. Üreticinin protokolünü takip etmeye devam edin (bkz. Malzeme Tablosu). CD34+ hücresinin akışkan çiplere tohumlanmasıNOT: Protokolde kullanılan akışkan çip, toplam 2,5cm2 büyüme alanı için 0,6 mm kanal yüksekliğine ve 50 mm uzunluğa sahiptir (Ek Şekil S1). Bu tip çip, toplam 150 μL hücre süspansiyonu hacmi ile tohumlanır. Farklı cipsler kullanılabilir ve tohumlama hacmi ve hücre yoğunluğu büyüme alanına göre uyarlanmalıdır. Kullanılan hücre hattına ve büyümesine bağlı olarak ek optimizasyon gerekebilir.İzole edilmiş CD34+ hücrelerini, 300 μL önceden ısıtılmış SFM-34 ortamında Mix 4 sitokinleri ile yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunun 10 μL’sini alın ve hücreleri sayın. SFM-34 takviyeli 150 μL’lik bir son hacimde 2.5 ×10 5 hücreyi yeniden süspanse edin; 0,5 μL iRock ekleyin.NOT: İzolasyonun etkinliğini test etmek için, 105 hücreyi/tüpü daha sonra akış sitometrisi için kullanılacak bir tüpe (sıralanmış test numunesi) aktarın (4.3.9-4.3.13 adımlarında açıklandığı gibi). Bir P200’ün ucunu kanalın kenarındaki rezervuarın içine koyarak laminini akışkan talaşlardan yavaşça aspire edin.NOT: Sıvının toplanması zorsa, sıvının karşı hazneye hareket etmesine yardımcı olmak için çipin bir tarafını yavaşça kaldırın. Kabarcık oluşmadığından emin olmak için hücre süspansiyonunu kanala sabit bir şekilde ekleyin.NOT: Lamininin kurumasını ve çip kanallarında kabarcık oluşumunu önlemek için 3.3.4-3.3.5 adımlarını hızlı ama nazikçe gerçekleştirin. Kabarcıklar oluşursa, çipin bir tarafını kaldırın ve kabarcıkları harekete geçirmek için sürgüye hafifçe vurun; Rezervuara ulaştıklarında hava arayüzüne yükselecekler ve kanalı kiralayamayacaklar. Çipi inkübatöre aktarın ve gece boyunca bırakın, böylece hücreler kanala tamamen bağlanır ve uzun görünür. Hücreler tamamen bağlandığında, besiyerini adım 3.3.4’teki gibi aspire edin ve 200 μL sitokin takviyeli SFM-34 ile değiştirin. Şu andan itibaren, hücreler% 90 -% 100 birleşmeye ulaşana kadar ortamı günlük olarak değiştirin. 4. Endotel hücrelerine sürekli akış uygulaması – Aort-on-a-chip Malzemeleri ve reaktifleri hazırlayın.Tablo 2’ye göre 18 mL SFM-34 ortamını Mix 4 sitokin ile takviye ederek Mix 4 SFM-34 ortamını hazırlayın ve gaz değişimini kolaylaştırmak için kapağı hafifçe çevrilmiş olarak inkübatörde 50 mL’lik bir tüpe yerleştirin. Seçilen perfüzyon setlerini ve akışkan kurulumu için kullanılacak herhangi bir boruyu inkübatöre gazdan arındırmak için yerleştirin. Akışkan sistem montajıPerfüzyon setini üreticinin protokolüne göre üniteye takın.NOT: cl kullanmayı unutmayınamps sistemde. Bu adım için kayar kelepçeler kullanılıyorsa, çipe bağlanmadan önce boru üzerinde kaydırılmaları gerekir. Yeni bir akışkan çip takın ve sitokin takviyeli SFM-34 ortamını ekleyin, her iki rezervuarı da başlıktaki steril koşullar altında doldurduğunuzdan emin olun. Kabarcık giderme programını ve kalibrasyon adımını gerçekleştirin. Bağlı setli akışkan üniteyi inkübatörden çıkarın ve davlumbaza aktarın; Hücreleri içeren cipsleri de inkübatörden alın. Boruyu test çipinin her iki tarafına sıkıştırın. Hortumu test çipinden çıkarın.NOT: Borunun ucundaki Luer konektöründe kabarcık olmadığını kontrol edin. Kabarcıklar görünüyorsa, bunları bir P200 pipeti kullanarak dikkatlice aspire edin ve gerekirse konektörün ortamla doldurulduğundan emin olmak için daha fazla ortam ekleyin. Hücreleri içeren çipi boruya bağlayın. Kelepçeleri çıkarın veya açın. Sistemi inkübatöre aktarın ve hava pompasını akışkan ünitesine bağlayın. Pompaya özel yazılımı (Ek Şekil S2) kullanarak önceden seçilmiş programı, Tablo 3’te açıklanan kesme geriliminin kademeli olarak artırılmasıyla başlatın.NOT: İhtiyaç duyulan belirli deneye bağlı olarak, stimülasyon programının optimizasyona ihtiyacı olabilir. Burada tarif edilen, fetal dolaşımın başlangıcında dorsal aort duvarı tarafından yaşandığı hesaplanan kayma gerilimini taklit eden 5 dyn/cm2’lik nihai değere yol açan kademeli bir kayma gerilimi artışıdır 9. Kullanılacak son kesme geriliminden bağımsız olarak, hücrelerin çipten ayrılmasına neden olmadan hücrelerin kuvvete uyum sağlamasına izin vermek için zaman içinde kademeli olarak artırmak gerekir. Seçilen stimülasyon protokolü 3 günden uzunsa, normalde 18 mL’ye eklenecek olan Mix 4 sitokinlerini içeren 1 mL SFM-34 eklenerek sitokinler sisteme eklenmelidir. Bunu yapmak için, pompa programı hızlı bir şekilde duraklatılır ve akışkan setindeki iki şırınganın her birine 500 μL ek ortam eklenir. Analiz için hücre toplamaAyrışma tamponunu bir su banyosunda önceden ısıtın. Akışkan üniteyi inkübatörden çıkarın ve davlumbazın içine taşıyın. Boruyu her iki taraftan talaşın etrafına sıkıştırın ve boruyu çip üzerindeki rezervuarlardan çıkarın. Ortamı çipten yavaşça çıkarın ve hücreleri yıkamak için DPBS Ca 2+ Mg2+ ile değiştirin.NOT: Hücreler ayrılmaya başlarsa, PBS ile yıkamanın bu adımı atlanabilir. Yavaşça 150 μL ayrışma tamponu ekleyin ve 37 °C’de 3 dakika inkübe edin.NOT: Hücrelerin tek ve müstakil olup olmadığını mikroskop altında kontrol edin; Aksi takdirde, 2 dakika daha inkübe edin. Çip, pipetleme yoluyla hücre ayrılmasına yardımcı olmadığından, ortamı aspire etmeden önce hücrelerin kanaldan tamamen ayrılması önemlidir. Hücreleri ayırmak için tripsin veya EDTA bazlı tamponlar gibi başka çözeltiler de kullanılabilir. Hücreleri içeren ayrışma tamponunu bir rezervuardan toplayın ve 15 mL’lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve tüm ayrılmış hücreleri toplamak için kanalı bir kez DPBS ile yıkayın. Hücrelerle birlikte 15 mL’lik tüpe 1 mL yıkama tamponu ekleyin ve hücreleri saymak için 10 μL alın. Hücre süspansiyonunu akış sitometri tüplerine, test tüpü başına 105 hücreye sahip olacak şekilde bölün. Tüpleri 300 × g’da 5 dakika döndürün. Boyama solüsyonunu, her test tüpünün boyanması için 50 μL’ye sahip olacak şekilde hazırlayın. CD34 PerCP-efluor710 veya CD34-PE’yi sırasıyla 1:100 ve 1:200 seyreltmede ekleyin. Hücreleri 50 μL boyama çözeltisinde yeniden süspanse edin ve 4 ° C’de 30 dakika inkübe edin. Hücreleri 2 mL yıkama tamponu ekleyerek yıkayın ve 300 × g’da 5 dakika döndürün. Peletleri 100 μL boyama çözeltisinde yeniden süspanse edin ve bir akış sitometresi kullanarak verileri elde edin.NOT: Hücreler ayrıca 150 μL RNA lizis tamponu kullanılarak RNA ekstraksiyonu için doğrudan çipte parçalanabilir veya oda sıcaklığında 10 dakika boyunca DPBS’de% 4 paraformaldehit kullanılarak görüntüleme için sabitlenebilir. Hücre oryantasyon analiziFIJI23 (Ek Şekil S3) kullanarak hücre yönündeki değişiklikleri ölçmek için görüntüleri analiz edin.İlgi Bölgesi (ROI) yöneticisini Analiz | Araçlar | ROI yöneticisi menüsü. Poligon seçim aracını kullanarak hücre konturlarını manuel olarak çizin ve Ekle’ye tıklayarak veya CTRL+T kısayolunu kullanarak bunları ROI yöneticisine ekleyin. Analiz | Ölçümler menüsünü ayarlayın . Ölçümü Tüm ROI’lere Daha fazla… ROI yöneticisinde çoklu ölçüm komutu.NOT: Bu adım, her ROI’ye bir elips sığdıracak ve açının yanı sıra büyük ve küçük elips eksenlerinin uzunluğunu içeren bir tablo oluşturacaktır. Tabloyu, çizmek için başka bir yazılıma aktarılacak bir CSV dosyasına aktarın.NOT: Çizimler için kullanılan komut dosyası şu adreste mevcuttur: https://gist.github.com/nicolaromano/708b3231d730ee7f70763a7cf8850ddc’yi seçin.