In Vitro Модель эмбрионального сосуда человека на чипе для изучения механобиологии развития

ПРИМЕЧАНИЕ: Все методы культивирования клеток должны выполняться в стерильных условиях в ламинарном колпаке, а клетки должны инкубироваться при 37 °C в гумифицированной атмосфере с 5%CO2. Инструкции по всем препаратам цитокинов как для поддерживающей терапии (rhbFGF), так и для протокола дифференцировки (rhBMP4, rhVEGF, rhbFGF, rhIL6, rhFLT3L, rhIGF1, rhIL11, rhSCF, rhEPO, rhTPO, rhIL3) приведены в Дополнительной таблице S1. 1. Культивирование ИПСК – размораживание, поддержание и замораживание клеток Приготовление поддерживающей среды, факторов роста и других реагентовПриготовьте питательную среду, добавив добавку с цельной сывороточной средой hESCs, 36 мл 25% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 1 мл 55 мМ β-меркаптоэтанола в базальную среду Dulbecco Modified Eagle Medium/F12 (DMEM/F-12) (см. таблицу материалов). Ресуспендировать 1 мг ингибитора Ро-киназы (iRock) в 1 мл ДМСО, сделать аликвоты по 50 мкл и хранить их при -20 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Эти аликвоты можно хранить при температуре -20 °C в течение 1 года. После размораживания их можно хранить при температуре 4 °C в течение 1 недели. Раствор витронектина (VTN-N) разморозить на льду и в количестве 60 мкл на флакон перед хранением при -80 °C. Непосредственно перед нанесением покрытия на планшеты разбавьте 60 мкл 60 мкл 6 мл фосфатно-солевого буфера (DPBS) Dulbecco; конечная концентрация 5 мкг/мл. Размораживание клеточной линии hiPSCПРИМЕЧАНИЕ: Линия плюрипотентных стволовых клеток человека SFCi55 была ранее получена и широко использовалась для дифференцировки в различные типы клеток и различные эмбриональные линии 19,20,21,22.Одну лунку 6-луночного планшета покрыть 1 мл раствора VTN-N в течение 1 ч при 37 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: После инкубации пластины с покрытием можно хранить при температуре 4 °C до 1 недели. Аспирировать раствор VTN-N с помощью аспирационной пипетки и добавить 1 мл предварительно подогретой питательной среды с добавлением 20 нг/мл rhbFGF (дополнительная таблица S1). Быстро разморозьте флакон с ИПСК на водяной бане и перенесите клетку в 5 мл предварительно подогретой питательной среды. Отжим клетки в течение 3 мин при температуре 300 × г при комнатной температуре. Ресуспендировать клеточную гранулу в 0,5 мл питательной среды с добавлением 20 нг/мл rhbFGF. Переложите клетки в одну лунку с покрытием, содержащую уже 1 мл среды. Добавьте 5 мкл iRock в лунки, содержащие клетки, в общей сложности 1,5 мл среды. Культивируйте клетки в инкубаторе, меняйте среду ежедневно в течение недели и дважды кормите клетки, добавляя в клетки в два раза больше нормального объема среды, чтобы обеспечить кормление в выходные дни.ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки выращиваются в присутствии iRock только в течение 24 часов. Поддержание и передача ИПСКЕжедневно меняйте среду свежей, предварительно подогретой питательной средой с добавлением 20 нг/мл rhbFGF. Проходите клетки, когда они достигают примерно 80% слияния, как правило, два раза в неделю.Для прохождения ячеек покройте пластину VTN-N, как описано ранее в шагах 1.2.1 и 1.2.2. Аспирировать среду из лунок с ячейками и промыть их ДПБС. Аспирировать ДПБС и добавить 1 мл диссоциационного реагента (см. таблицу материалов) и инкубировать в течение 1 мин. Отсасывайте реагент для диссоциации и инкубируйте еще 3 мин. Сильно постучите по тарелке 10 раз с каждой стороны.ПРИМЕЧАНИЕ: На этапе диссоциации может потребоваться оптимизация времени инкубации и процедуры постукивания в зависимости от типа клетки. Добавьте 1 мл питательной среды к клеткам и пипеткой Пастера промойте их один раз, чтобы убедиться, что большая часть колоний собрана. Добавьте 150 мкл клеточной суспензии в каждую лунку, чтобы обеспечить коэффициент пассажа 1 лунка к 6.ПРИМЕЧАНИЕ: Сразу после размораживания нового флакона лучше пассировать клетки в более низком соотношении, например, 1:1 или 1:2 в течение одного или двух проходов, чтобы они достигли устойчивой фазы роста, прежде чем пассировать в соотношении 1:6. Культивируйте клетки в инкубаторе, меняйте среду ежедневно в течение недели и дважды подкармливайте клетки один раз в выходные. Замораживание клеточной линии ИПСКПРИМЕЧАНИЕ: Замораживайте клетки в течение первых двух проходов после размораживания, чтобы обеспечить постоянное количество замороженных флаконов с низким проходом для начала культивирования. Заморозьте клетки, когда они достигнут слияния примерно 80%.Смените среду на свежую, предварительно подогретую питательную среду с добавлением 20 нг/мл rhbFGF и 5 мкл iRock и инкубируйте не менее 1 ч. Отсоедините ячейки, как описано в шагах 1.3.2.2-1.3.2.5. Соберите отделенные клетки в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл питательной среды. Центрифугу в течение 3 мин при 300 × г при комнатной температуре. Отсасывают надосадочную жидкость и добавляют 1 мл раствора криоконсервации (см. Таблицу материалов). С помощью пипетки Пастера осторожно пропипетируйте клетки вверх и вниз, чтобы смешать их в растворе для криоконсервации.ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте чрезмерного пипетирования, которое может привести к диссоциации клеточных кластеров. Разделите клеточную суспензию на два криоконсервационных флакона по 0,5 мл каждый. Переложите криоконсервационные флаконы в контейнер для криоконсервации, предварительно охлажденный до 4 °C. Переместите контейнер с ячейками в морозильную камеру с температурой -80 °C на 24 часа, прежде чем переместить флаконы в жидкий азот для длительного хранения. 2. Дифференцировка ИПСК в эндотелиальные клетки Приготовление дифференцировочной среды, цитокинов и факторов ростаГотовят бессывороточную дифференцировочную среду (СФО) в соответствии с таблицей 1. Используйте это средство с 0-го по 5-й день дифференциации. Приготовьте безсывороточную среду для клеток CD34+ (SFM-34), добавив 34 питательные добавки и 5 мл добавки L-глютамина в базальную среду 34 SFM (см. таблицу материалов). Используйте это средство, начиная с 6-го дня дифференциации. Ресуспендировать 1 мг CHIR99021 в 716 мкл ДМСО для получения 3 мМ раствора. Инкубировать при комнатной температуре до полной ресуспендации; при необходимости быстро прогрейте до 37 °C. Изготовьте аликвоты объемом 20 мкл и храните их при -20 °C до 6 месяцев. Используйте сразу после размораживания, не замораживайте повторно и не храните. Ресуспендируйте цитокины в соответствии с инструкцией, приведенной в дополнительной таблице S1. Все аликвоты цитокинов хранят при температуре -80 °C. Дифференцировка эндотелиальных клетокПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого дня дифференцировки приготовьте 18 мл (3 мл среды/лунки) предварительно подогретой среды SFD в соответствии со смесями цитокинов, описанными в Таблица 2.День 0 – формирование эмбриоидных телец (ЭБ)Приготовьте 18 мл среды SFD с цитокином Mix 1 в соответствии с таблицей 2 для каждой 6-луночной чашки (3 мл/лунка). Добавьте 2 мл предварительно подогретой среды SFD с Смешайте по 1 цитокину в каждой лунке 6-луночного планшета, отталкивающего клетки (см. таблицу материалов). Чтобы сформировать EB, выполните действия, описанные в шагах 1.3.2.2-1.3.2.4.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ИПСК сливаются на 70-80%, чтобы начать дифференцировку. Добавьте 1 мл предварительно подогретой среды SFD с цитокинами Mix 1 в каждую лунку отделенных клеточных кластеров. Используйте пипетку Пастера, чтобы аккуратно переместить клеточные кластеры в одну лунку с клеточными репеллентами для образования ЭП в соотношении 1:1. Поместив пластину в инкубатор, перемещайте ее вперед и назад, вправо и влево, чтобы равномерно распределить ЭБ в лунке. День 1 – средняя смена EBПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим только в том случае, если к 1-му дню дифференцировки в суспензии находится много одиночных клеток вместе с БЭ.Приготовьте 18 мл среды SFD с цитокином Mix 1 в соответствии с таблицей 2 для каждой 6-луночной чашки (3 мл/лунка). Вращайте пластину с ЭБ, чтобы переместить их в центр, и соберите их с помощью пипетки Пастера в центрифужную пробирку объемом 15 мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Если EB выглядят слипшимисяся, как в нити, разделите их, пипетируя вверх и вниз с помощью P1000, прежде чем собрать их в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Подождите 5-10 минут, пока ЭБ не осядут на дне пробирки.ПРИМЕЧАНИЕ: Если ЭБ слишком малы, центрифугируйте их в течение 5 минут при 100 × г , чтобы они успокоились. Промойте пластины, отталкивающие клетки, стерильной водой или DPBS, чтобы удалить отдельные клетки или мусор. Осторожно и медленно отсасывайте надосадочную жидкость из ЭБ, не выбивая их. Добавьте 2 мл SFD с цитокинами Mix 1 в каждую лунку клеточных репеллентных пластин. Ресуспендируйте ЭБ, используя 1 мл среды SFD с цитокинами Mix 1 для каждой стартовой лунки – для 6-луночного планшета добавьте 6 мл среды. Переносят ЭБ на клеточные репеллентные пластины в объеме 1 мл на лунку, которая уже содержит 2 мл среды SFD. Поместив пластину в инкубатор, перемещайте ее вперед и назад, вправо и влево, чтобы равномерно распределить ЭБ в лунке. День 2 – добавление CHIR99021Вкрутите ЭБ в центр пластины и добавьте CHIR99021 в соответствии с таблицей 2 на боковой стороне лунки, чтобы избежать прямого контакта с ячейками.ПРИМЕЧАНИЕ: Если среда не была заменена в 1-й день, замените всю среду, а не только CHIR. Приготовьте 18 мл среды SFD со смесью 2 в соответствии с таблицей 2 для каждой 6-луночной чашки (3 мл/лунка). Поместив пластину в инкубатор, перемещайте ее вперед и назад, вправо и влево, чтобы равномерно распределить ЭБ в лунке. День 3 – изменение среднего уровня БЭ и добавление цитокинов Mix 3Приготовьте 18 мл среды SFD со смешайте 3 цитокина в соответствии с таблицей 2 для каждой 6-луночной чашки (3 мл/лунка). Соберите EB, как описано в шагах 2.2.2.2-2.2.2.4. Добавьте предварительно подогретые 2 мл среды SFD с цитокинами Mix 3 на пластины, отталкивающие клетки. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость из ЭБ. Добавьте 1 мл/лунку SFD со смесью 3 цитокинов. Распределите ЭБ между лунками, как описано в шагах 2.2.2.8-2.2.2.9. День 6 – изменение среднего уровня SFM-34 и добавление цитокинов Mix 4Приготовьте 18 мл среды SFD с 4 цитокинами в соответствии с таблицей 2 для каждой 6-луночной пластины (3 мл/лунка). Соберите EB, как описано в шагах 2.2.2.2-2.2.2.4. Добавьте 2 мл предварительно подогретой среды SFM-34 с цитокинами Mix 4 на пластины, отталкивающие клетки. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость из ЭБ. Добавьте 1 мл/лунку SFM-34 со смешайте 4 цитокина. Распределите ЭБ между лунками, как описано в шагах 2.2.2.8-2.2.2.9. 3. Выделение CD34+ клеток и посев в чип ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки CD34+ выделяют методом положительной изоляции с помощью набора микрогранул CD34 (см. таблицу материалов), который содержит микрогранулы CD34, конъюгированные с моноклональными мышиными антителами, антитела CD34 и реагент, блокирующий FcR (Human IgG). Важно проверить эффективность изоляции колонки путем окрашивания клеток до и после выделения для анализа методом проточной цитометрии, Ниже указано, когда необходимо взять клетки для этого анализа. Подготовьте материалы и реактивы.Приготовьте промывочный буфер, добавив 5 мл 5% раствора БСА и 200 мкл ЭДТА 0,5 М к 45 мл ДПБС для получения PBS + 0,5% БСА + 2 мМ ЭДТА. Готовьте свежие для каждой изоляции, процеживайте, стерилизуйте и храните в холодильнике до использования. Жидкостную стружку покрыть раствором ламинина, приготовленным путем разведения rhLaminin 521 1:50 в DPBS Ca 2+ Mg2+. Покройте каждую стружку соответствующим объемом для используемой стружки и инкубируйте в инкубаторе в течение 2 ч перед посевом.ПРИМЕЧАНИЕ: Для покрытия могут быть использованы другие матрицы, которые должны быть протестированы для конкретного типа клеток/эксперимента. Приготовьте среду Mix 4 SFM-34, добавив 18 мл среды SFM-34 цитокинами Mix 4 в соответствии с таблицей 2 , и поместите смесь в пробирку объемом 50 мл в инкубатор с слегка отвинченной крышкой для облегчения газообмена. Поместите выбранные перфузионные наборы и любые другие трубки, которые будут использоваться в инкубаторе, для дегазации. 8 день – диссоциация БЭ и выделение CD34+Соберите EB, как описано в шагах 2.2.2.2-2.2.2.5. Добавьте 1 мл реагента для диссоциации клеток на каждую стартовую лунку собранных ЭБ (если было собрано 6 лунок, добавьте 6 мл). Перенесите обратно 1 мл суспензии ЭБ в реагенте для диссоциации клеток в каждую лунку пластины, отпугивающей клетку. Инкубируют в течение 10 мин в инкубаторе. Осторожно пипетируйте ЭБ вверх и вниз с помощью P1000 не более 10 раз. Повторите шаги 3.2.4-3.2.5, чтобы получить в общей сложности 3 раза.ПРИМЕЧАНИЕ: Если ЭБ трудно диссоциировать, повторите описанные выше шаги в общей сложности 4 раза. Добавьте 5 мл промывочного буфера на каждую лунку диссоциированных ЭБ. Соберите клетки в центрифужную пробирку объемом 50 мл, пропустив их через ситечко 40 мкм. Возьмите 10 мкл клеточной суспензии, чтобы подсчитать клетки.ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проверить эффективность изоляции, пересадите 105 клеток/пробирку в две разные пробирки (неокрашенный контрольный и предварительно отсортированный тестовый образец), которые будут использоваться позже для проточной цитометрии (как описано в шагах 4.3.9-4.3.13). Для 6-луночной планшета после фильтрации следует собрать ~106 ячеек. Отжимайте клетки в течение 10 мин при 300 × г. Повторно суспендируйте клетки в 300 мкл промывочного буфера, осторожно пипетируя несколько раз, чтобы убедиться в отсутствии комков. Продолжайте следовать протоколу производителя (см. Таблицу материалов). Посев CD34+ клеток в жидкостные чипыПРИМЕЧАНИЕ: Жидкостный чип, используемый в протоколе, имеет высоту канала 0,6 мм и длину 50 мм, что обеспечивает общую площадь роста 2,5см2 (дополнительный рисунок S1). Этот тип чипов засевается общим объемом клеточной суспензии 150 мкл. Можно использовать различные чипы, а объем затравки и плотность клеток должны быть адаптированы в соответствии с областью роста. Может потребоваться дополнительная оптимизация в зависимости от используемой клеточной линии и ее роста.Ресуспендант изолированных CD34+ клеток в 300 мкл предварительно нагретой среды SFM-34 с цитокинами Mix 4. Возьмите 10 мкл клеточной суспензии и посчитайте клетки. Ресуспендировать 2,5 × 105 ячеек в конечном объеме 150 мкл с добавкой SFM-34; добавьте 0,5 мкл iRock.ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проверить эффективность выделения, перенесите 105 клеток/пробирку в пробирку (тестовый образец после сортировки), которая будет использоваться позже для проточной цитометрии (как описано в шагах 4.3.9-4.3.13). Медленно отсасывайте ламинин из жидкой стружки, поместив наконечник P200 внутрь резервуара на краю канала.ПРИМЕЧАНИЕ: Если жидкость трудно собрать, медленно поднимите одну сторону стружки, чтобы помочь жидкости переместиться в противоположный резервуар. Постепенно добавляйте клеточную суспензию в канал, чтобы убедиться, что не образуются пузырьки.ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте шаги 3.3.4-3.3.5 быстро, но аккуратно, чтобы избежать высыхания ламинина и образования пузырьков в каналах стружки. Если образуются пузырьки, поднимите одну сторону чипа и осторожно постучите по слайду, чтобы мобилизовать пузырьки; Когда они достигнут водохранилища, они поднимутся на воздушную границу и не смогут войти в канал. Перенесите чип в инкубатор и оставьте на ночь, чтобы клетки полностью прикрепились к каналу и выглядели вытянутыми. Когда клетки полностью прикрепятся, аспирируйте среду, как показано на этапе 3.3.4, и замените ее 200 мкл SFM-34 с добавлением цитокинов. С этого момента заменяйте среду ежедневно до тех пор, пока ячейки не достигнут 90%-100% слияния. 4. Применение непрерывного потока к эндотелиальным клеткам – Аорта-на-чипе Подготовьте материалы и реактивы.Приготовьте среду Mix 4 SFM-34, добавив 18 мл среды SFM-34 цитокинами Mix 4 в соответствии с таблицей 2 и поместив ее в пробирку объемом 50 мл в инкубатор с слегка отвинченной крышкой для облегчения газообмена. Поместите выбранные перфузионные наборы и все трубки, которые будут использоваться для установки жидкости, в инкубатор для дегазации. Сборка жидкостной системыУстановите перфузионный набор в аппарат в соответствии с протоколом производителя.ПРИМЕЧАНИЕ: Не забывайте использовать зажимы в системе. Если для этого шага используются скользящие зажимы, их необходимо надеть на трубку перед подключением к чипу. Прикрепите новый жидкостный чип и добавьте питательную среду SFM-34 с цитокинами, убедившись, что оба резервуара заполнены в стерильных условиях в колпаке. Выполните программу удаления пузырьков и этап калибровки. Извлеките жидкостный блок с подключенным комплектом из инкубатора и перенесите его в колпак; Возьмите также стружку, содержащую клетки из инкубатора. Зажмите трубку с обеих сторон испытуемой стружки. Снимите трубку с тестовой стружки.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что в соединителе Луэра на конце трубки нет пузырьков. Если пузырьки видны, осторожно аспирируйте их с помощью пипетки P200 и при необходимости добавьте больше среды, чтобы убедиться, что соединитель заполнен средой. Соедините микросхему, содержащую ячейки, с трубкой. Снимите или откройте зажимы. Перенесите систему в инкубатор и подключите воздушный насос к жидкостному блоку. Запустите предварительно выбранную программу с помощью специального программного обеспечения для насоса (дополнительный рисунок S2) с постепенным увеличением напряжения сдвига, описанного в таблице 3.ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от конкретного эксперимента, который необходим, программа стимуляции может нуждаться в оптимизации. Здесь описано постепенное увеличение напряжения сдвига, приводящее к конечному значению 5 дин/см2, которое имитирует напряжение сдвига, которое, по расчетам, испытывает стенка дорсальной аорты в начале кровообращения плода 9. Независимо от конечного напряжения сдвига, которое будет использоваться, его необходимо постепенно увеличивать с течением времени, чтобы позволить элементам адаптироваться к силе, не вызывая их отрыва от чипа. Если выбранный протокол стимуляции длится более 3 дней, цитокины следует долить в систему, добавив 1 мл SFM-34, содержащего цитокины Mix 4, которые обычно добавляются в 18 мл. Для этого программу помпы быстро приостанавливают и добавляют 500 мкл добавленной среды в каждый из двух шприцев в наборе жидкости. Забор клеток для анализаРазогрейте диссоциационный буфер на водяной бане. Извлеките жидкостный блок из инкубатора и переместите его в колпак. Зажмите трубку, обрамляющую стружку, с обеих сторон и извлеките трубки из резервуаров на стружке. Аккуратно удалите среду с чипа и замените ее DPBS Ca 2+ Mg2+, чтобы промыть ячейки. ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап промывки PBS можно пропустить, если клетки начинают отделяться. Осторожно добавьте 150 мкл диссоциационного буфера и инкубируйте в течение 3 минут при 37 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте под микроскопом, являются ли клетки одиночными и отделенными; В противном случае инкубируйте еще 2 мин. Важно, чтобы клетки были полностью отделены от канала перед аспирацией среды, так как чип не позволяет способствовать отсоединению клеток путем пипетирования. Для отделения клеток могут быть использованы другие растворы, такие как трипсин или буферы на основе ЭДТА. Соберите диссоциационный буфер, содержащий клетки, из одного резервуара, переложите в центрифужную пробирку объемом 15 мл и промойте канал один раз DPBS, чтобы собрать все отделившиеся клетки. Добавьте 1 мл промывочного буфера в пробирку объемом 15 мл с ячейками и возьмите 10 мкл для подсчета клеток. Разделите клеточную суспензию на пробирки для проточной цитометрии так, чтобы в пробирке оставалось от 10до 5 клеток. Вращайте пробирки в течение 5 мин при 300 × г. Приготовьте раствор для окрашивания так, чтобы на каждую пробирку для окрашивания оставалось 50 мкл. Добавьте CD34 PerCP-efluor710 или CD34-PE в разведении 1:100 и 1:200 соответственно. Ресуспендируйте клетки в 50 мкл раствора для окрашивания и инкубируйте в течение 30 мин при 4 °C. Промойте клетки, добавив 2 мл промывочного буфера, и отжим в течение 5 мин при 300 × г. Ресуспендируйте гранулы в 100 мкл красящего раствора и получите данные с помощью проточного цитометра.ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки также могут быть лизированы непосредственно в чипе для экстракции РНК с использованием 150 мкл лизисного буфера РНК или зафиксированы для визуализации с использованием 4% параформальдегида в DPBS в течение 10 минут при комнатной температуре. Анализ ориентации ячеекПроанализируйте изображения, чтобы количественно оценить изменения ориентации ячеек с помощью FIJI23 (дополнительный рисунок S3).Откройте диспетчер области интереса (ROI) в меню Анализ | Инструменты | Меню менеджера ROI. Нарисуйте контуры ячеек вручную с помощью инструмента «Выделение полигонов » и добавьте их в диспетчер ROI, нажав кнопку « Добавить » или используя сочетание клавиш CTRL+T . Измерьте ориентацию каждого ROI, выбрав меру Подогнать эллипс в окне Анализ | Меню «Установить измерения». Примените измерение ко всем показателям рентабельности инвестиций с помощью кнопки Подробнее… Команда Multi Measure в менеджере ROI.ПРИМЕЧАНИЕ: На этом шаге мы подгоним эллипс к каждому ROI и создадим таблицу, содержащую длину большой и малой осей эллипса, а также угол. Экспортируйте таблицу в CSV-файл для импорта в другое программное обеспечение для построения графиков.ПРИМЕЧАНИЕ: Скрипт, используемый для графиков, доступен по адресу https://gist.github.com/nicolaromano/708b3231d730ee7f70763a7cf8850ДДК.