In vitro Model van foetaal menselijk vat op chip om ontwikkelingsmechanobiologie te bestuderen

OPMERKING: Alle celkweektechnieken moeten worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een laminaire stroomkap en cellen moeten worden geïncubeerd bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 . Instructies voor alle cytokinepreparaten voor zowel onderhoud (rhbFGF) als voor het differentiatieprotocol (rhBMP4, rhVEGF, rhbFGF, rhIL6, rhFLT3L, rhIGF1, rhIL11, rhSCF, rhEPO, rhTPO, rhIL3) staan in aanvullende tabel S1. 1. Kweken van hiPSC’s – ontdooien, onderhouden en invriezen van cellen Bereiding van onderhoudsmedium, groeifactoren en andere reagentiaBereid het kweekmedium voor door het hele hESC’s serumvrije mediumsupplement, 36 ml van 25% runderserumalbumine (BSA) en 1 ml van 55 mM β-mercaptoethanol toe te voegen aan Dulbecco’s Modified Eagle Medium/F12 (DMEM/F-12) basaal medium (zie materiaaltabel). Resuspendeer 1 mg Rho Kinase-remmer (iRock) in 1 ml DMSO, maak aliquots van 50 μL en bewaar deze bij -20 °C.OPMERKING: Deze aliquots kunnen gedurende 1 jaar bij -20 °C worden bewaard. Eenmaal ontdooid zijn ze 1 week houdbaar bij 4 °C. Ontdooi de vitronectine (VTN-N)-oplossing op ijs en aliquot 60 μL per injectieflacon voordat u het bij -80 °C bewaart. Verdun vlak voor het coaten van de platen de 60 μL bouillon in 6 ml Dulbecco’s fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS); de eindconcentratie van 5 μg/ml. hiPSC-cellijn ontdooienOPMERKING: De menselijke pluripotente stamcellijn SFCi55 werd eerder in eigen huis afgeleid en op grote schaal gebruikt voor differentiatie in verschillende celtypen en verschillende embryonale lijnen 19,20,21,22.Smeer een putje van een plaat met 6 putjes in met 1 ml VTN-N-oplossing gedurende 1 uur bij 37 °C.OPMERKING: Na incubatie kunnen gecoate platen maximaal 1 week bij 4 °C worden bewaard. Zuig de VTN-N-oplossing op met een aspiratiepipet en voeg 1 ml voorverwarmd kweekmedium toe, aangevuld met 20 ng/ml rhbFGF (aanvullende tabel S1). Ontdooi de injectieflacon met de hiPSC’s snel in een waterbad en breng de cel over in 5 ml voorverwarmd kweekmedium. Draai de cellen 3 minuten op 300 × g bij kamertemperatuur. Resuspendeer de celpellet in 0,5 ml kweekmedium aangevuld met 20 ng/ml rhbFGF. Breng de cellen over naar een gecoat putje dat al 1 ml medium bevat. Voeg 5 μL iRock toe aan de putjes met de cellen in een totaal van 1,5 ml medium. Kweek de cellen in de couveuse, vervang het medium dagelijks gedurende de week en voer de cellen dubbel, waarbij u twee keer het normale volume medium aan de cellen toevoegt om ervoor te zorgen dat u in het weekend wordt gevoed.OPMERKING: Cellen worden slechts 24 uur in aanwezigheid van iRock gekweekt. Onderhoud en doorgifte van hiPSC’sVervang het medium dagelijks met vers voorverwarmd kweekmedium aangevuld met 20 ng/ml rhbFGF. Passeer de cellen wanneer ze ongeveer 80% samenvloeiing bereiken, meestal twee keer per week.Om de cellen te passeren, bedek je een plaat met VTN-N zoals eerder beschreven in de stappen 1.2.1 en 1.2.2. Zuig het medium uit de putjes op met cellen en was ze met DPBS. Zuig het DPBS op en voeg 1 ml dissociatiereagens toe (zie Materiaaltabel) en incubeer gedurende 1 minuut. Zuig het dissociatiereagens op en incubeer nog eens 3 minuten. Tik 10 keer stevig op de plaat aan elke kant.OPMERKING: Voor de dissociatiestap moet mogelijk celtypespecifieke optimalisatie nodig zijn in de incubatietijd en de tapprocedure. Voeg 1 ml kweekmedium toe aan de cellen en was met een pasteurpipet eenmaal met het medium om ervoor te zorgen dat de meeste kolonies worden opgevangen. Voeg 150 μL van de celsuspensie toe aan elk putje om een doorgangsverhouding van 1 putje op 6 te verkrijgen.OPMERKING: Onmiddellijk na het ontdooien van een nieuwe injectieflacon is het beter om de cellen in een lagere verhouding te passeren, zoals 1:1 of 1:2 voor een of twee passages, zodat ze een gestage groeifase kunnen bereiken voordat ze passeren in een verhouding van 1:6. Kweek de cellen in de couveuse, vervang het medium dagelijks gedurende de week en voer de cellen één keer dubbel in het weekend. hiPSC’s cellijn bevriezenOPMERKING: Vries de cellen in de eerste twee passages na het ontdooien in om ervoor te zorgen dat er een constante lage doorgangsbatch van bevroren injectieflacons blijft om de kweek te starten. Bevries de cellen wanneer ze een samenvloeiing van ongeveer 80% bereiken.Vervang het medium door vers voorverwarmd kweekmedium aangevuld met 20 ng/ml rhbFGF en 5 μL iRock en incubeer gedurende ten minste 1 uur. Maak de cellen los zoals beschreven in de stappen 1.3.2.2-1.3.2.5. Verzamel de losgemaakte cellen in een centrifugebuisje van 15 ml met 5 ml kweekmedium. Centrifugeer gedurende 3 minuten op 300 × g bij kamertemperatuur. Zuig het supernatans op en voeg 1 ml cryopreservatieoplossing toe (zie Materiaaltabel). Gebruik een pasteurpipet om de cellen voorzichtig op en neer te pipetten om ze in de cryopreservatie-oplossing te mengen.OPMERKING: Vermijd overmatig pipetteren, dit kan leiden tot dissociatie van de celclusters. Verdeel de celsuspensie in twee cryopreservatieflacons van elk 0,5 ml. Breng de cryopreservatieflacons over in een cryopreservatiecontainer die is voorgekoeld bij 4 °C. Breng de container met de cellen gedurende 24 uur over naar een vriezer van -80 °C voordat u de injectieflacons overbrengt naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag. 2. Differentiatie van hiPSC’s in endotheelcellen Bereiding van differentiatiemedium, cytokines en groeifactorenBereid serumvrij differentiatiemedium (SFD) volgens tabel 1. Gebruik dit medium van dag 0 tot dag 5 van differentiatie. Bereid serumvrij medium voor CD34+ -cellen (SFM-34) door 34 voedingssupplementen en 5 ml L-glutaminesupplement toe te voegen aan het 34 SFM Basal Medium (zie materiaaltabel). Gebruik dit medium vanaf dag 6 van differentiatie. Resuspendeer 1 mg CHIR99021 in 716 μL DMSO om een oplossing van 3 mM te verkrijgen. Incubeer bij kamertemperatuur tot het volledig geresuspendeerd is; indien nodig snel opwarmen bij 37 °C. Maak aliquots van 20 μl en bewaar ze maximaal 6 maanden bij -20 °C. Direct na ontdooien gebruiken en niet opnieuw invriezen of bewaren. Resuspendeer de cytokines volgens de instructies in aanvullende tabel S1. Bewaar de aliquots van alle cytokines bij -80 °C. Differentiatie van endotheelcellenOPMERKING: Bereid voor elke dag van de differentiatie 18 ml (3 ml medium/well) voorverwarmd SFD-medium, volgens de cytokinemengsels beschreven in Tabel 2.Dag 0 – vorming van embryoïde lichamen (EB’s)Bereid 18 ml SFD-medium met Mix 1 cytokine volgens tabel 2, voor elke plaat met 6 putjes (3 ml/putje). Voeg 2 ml voorverwarmd SFD-medium met Mix 1 cytokine toe in elk putje van een celafstotende plaat met 6 putjes (zie Materiaaltabel). Om EB’s te vormen, volgt u de stappen die worden beschreven in de stappen 1.3.2.2-1.3.2.4.NOTITIE: Zorg ervoor dat hiPSC’s voor 70-80% samenvloeiend zijn om de differentiatie te starten. Voeg 1 ml voorverwarmd SFD-medium met Mix 1 cytokines toe aan elk putje van losgemaakte celclusters. Gebruik een pasteurpipet om de celclusters voorzichtig over te brengen in een enkel putje met celafstotend putje voor EB-vorming in een verhouding van 1:1. Nadat u de plaat in de couveuse hebt geplaatst, beweegt u deze naar voren en naar achteren, naar rechts en naar links, om de EB’s gelijkmatig in de put te verdelen. Dag 1 – gemiddelde verandering in de EB’sOPMERKING: Deze stap is alleen nodig als er op dag 1 van de differentiatie veel afzonderlijke cellen in suspensie zijn naast de EB’s.Bereid 18 ml SFD-medium met Mix 1 cytokine volgens tabel 2, voor elke plaat met 6 putjes (3 ml/putje). Draai de plaat met de EB’s om ze naar het midden te verplaatsen en vang ze op met een pasteurpipet in een centrifugebuis van 15 ml.OPMERKING: Als de EB’s er samengeklonterd uitzien zoals in strings, scheid ze dan door ze op en neer te pipetteren met een P1000 voordat u ze opvangt in de centrifugebuis van 15 ml. Wacht 5-10 minuten totdat de EB’s zich op de bodem van de buis hebben genesteld.OPMERKING: Als de EB’s te klein zijn, centrifugeer ze dan 5 minuten op 100 × g om ze te helpen bezinken. Was de celafstotende platen met steriel water of DPBS om losse cellen of vuil te verwijderen. Zuig het supernatans voorzichtig en langzaam op uit de EB’s zonder ze los te maken. Voeg 2 ml SFD met Mix 1 cytokines toe aan elk putje van de celafstotende platen. Resuspendeer de EB’s met 1 ml SFD-medium met Mix 1 cytokines voor elk startputje – voeg voor een plaat met 6 putjes 6 ml medium toe. Breng de EB’s over naar de celafstotende platen in 1 ml volume per putje, dat al 2 ml SFD-medium bevat. Nadat u de plaat in de couveuse hebt geplaatst, beweegt u deze naar voren en naar achteren, naar rechts en naar links, om de EB’s gelijkmatig in de put te verdelen. Dag 2 – toevoeging van CHIR99021Draai de EB’s in het midden van de plaat en voeg CHIR99021 volgens tabel 2 toe aan de zijkant van het putje om direct contact met de cellen te voorkomen.OPMERKING: Als het medium op dag 1 niet is gewijzigd, vervang dan het hele medium in plaats van alleen CHIR toe te voegen. Bereid 18 ml SFD-medium met Mix 2 volgens tabel 2, voor elke plaat met 6 putjes (3 ml/putje). Nadat u de plaat in de couveuse hebt geplaatst, beweegt u deze naar voren en naar achteren, naar rechts en naar links, om de EB’s gelijkmatig in de put te verdelen. Dag 3 – gemiddelde verandering in de EB’s en toevoeging van Mix 3-cytokinesBereid 18 ml SFD-medium met Meng 3 cytokines volgens tabel 2, voor elke plaat met 6 putjes (3 ml/putje). Verzamel de EB’s zoals beschreven in de stappen 2.2.2.2-2.2.2.4. Voeg voorverwarmde 2 ml SFD-medium met Mix 3 cytokines toe aan de celafstotende platen. Zuig het supernatans voorzichtig op uit de EB’s. Voeg 1 ml/putje SFD toe met Meng 3 cytokines. Verdeel de EB’s over de putten zoals beschreven in de stappen 2.2.2.8-2.2.2.9. Dag 6 – gemiddelde verandering voor SFM-34 en toevoeging van Mix 4-cytokinesBereid 18 ml SFD-medium met Meng 4 cytokines volgens tabel 2, voor elke plaat met 6 putjes (3 ml/putje). Verzamel de EB’s zoals beschreven in de stappen 2.2.2.2-2.2.2.4. Voeg 2 ml voorverwarmd SFM-34 medium met Mix 4 cytokines toe aan de celafstotende platen. Zuig het supernatans voorzichtig op uit de EB’s. Voeg 1 ml/putje SFM-34 toe met Mix 4 cytokines. Verdeel de EB’s over de putten zoals beschreven in de stappen 2.2.2.8-2.2.2.9. 3. CD34+ cellen isolatie en seeding in de chip OPMERKING: CD34+ -cellen worden geïsoleerd via een positieve isolatiebenadering met een CD34-microbeadkit (zie Materiaaltabel), die CD34-microbeads bevat die zijn geconjugeerd aan monoklonale muisantilichamen, anti-menselijke CD34-antilichamen en FcR-blokkerend reagens (Human IgG). Het is belangrijk om de efficiëntie van de kolomisolatie te valideren door cellen voor en na de isolatie te kleuren voor flowcytometrie-analyse, Hieronder wordt aangegeven wanneer cellen moeten worden genomen voor deze analyse. Bereid materialen en reagentia voor.Bereid de wasbuffer voor door 5 ml 5% BSA-oplossing en 200 μl EDTA 0,5 M toe te voegen aan 45 ml DPBS om PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA te verkrijgen. Bereid vers voor elke isolatie, filter en steriliseer en bewaar gekoeld tot gebruik. Smeer de fluïdische spaanders in met een laminineoplossing die is bereid door rhLaminin 521 1:50 te verdunnen in DPBS Ca 2+ Mg2+. Smeer elke chip in met het juiste volume voor de gebruikte chip en incubeer 2 uur voor het zaaien in de incubator.OPMERKING: Andere matrices kunnen worden gebruikt voor de coating en moeten worden getest voor het specifieke celtype/experiment. Bereid Mix 4 SFM-34 medium voor door 18 ml SFM-34 medium aan te vullen met Mix 4 cytokines volgens tabel 2 en plaats het mengsel in een buis van 50 ml in de incubator met het deksel iets losgeschroefd om de gasuitwisseling te vergemakkelijken. Plaats de geselecteerde perfusiesets en eventuele andere te gebruiken slangen in de incubator om te ontgassen. Dag 8 – dissociatie van EB’s en CD34+ isolatieVerzamel de EB’s zoals beschreven in de stappen 2.2.2.2-2.2.2.5. Voeg 1 ml celdissociatiereagens toe per startputje van verzamelde EB’s (als er 6 putjes zijn verzameld, voeg dan 6 ml toe). Breng 1 ml van de EB-suspensie in het celdissociatiereagens terug naar elk putje van de celafstotende plaat. Incubeer gedurende 10 minuten in de couveuse. Pipeteer de EB’s voorzichtig op en neer tegen de put met een P1000, niet meer dan 10 keer. Herhaal stap 3.2.4-3.2.5.voor een totaal van 3x.LET OP: Als de EB’s moeilijk te scheiden zijn, herhaal dan de bovenstaande stappen in totaal 4x. Voeg 5 ml wasbuffer toe voor elk putje gedissocieerde EB’s. Verzamel de cellen in een centrifugebuis van 50 ml door ze door een zeef van 40 μm te halen. Neem 10 μL van de celsuspensie om de cellen te tellen.OPMERKING: Om de efficiëntie van de isolatie te testen, brengt u 10 cellen/buis van5 over in twee verschillende buizen (ongekleurde controle- en voorgesorteerd testmonster) die later zullen worden gebruikt voor flowcytometrie (zoals beschreven in stappen 4.3.9-4.3.13). Voor een plaat met 6 putjes moeten ~106 cellen worden verzameld na filtratie. Draai de cellen gedurende 10 minuten rond op 300 × g. Resuspendeer de cellen in 300 μL wasbuffer en pipetter een paar keer voorzichtig om er zeker van te zijn dat er geen klonten aanwezig zijn. Blijf het protocol van de fabrikant volgen (zie Materiaaltabel). CD34+ cel seeding in fluïdische chipsOPMERKING: De fluïdische chip die in het protocol wordt gebruikt, heeft een kanaalhoogte van 0,6 mm en een lengte van 50 mm, voor een totaal groeioppervlak van 2,5cm2 (aanvullende afbeelding S1). Dit type chip wordt gezaaid met een totaal volume celsuspensie van 150 μL. Er kunnen verschillende chips worden gebruikt en het volume van het zaaien en de celdichtheid moeten worden aangepast aan het groeigebied. Aanvullende optimalisatie kan nodig zijn, afhankelijk van de gebruikte cellijn en de groei ervan.Resuspendeer de geïsoleerde CD34+ -cellen in 300 μL voorverwarmd SFM-34-medium met Mix 4-cytokines. Neem 10 μL van de celsuspensie en tel de cellen. Resuspendeer 2,5 × 105 cellen in een eindvolume van 150 μL aangevuld SFM-34; voeg 0,5 μL iRock toe.OPMERKING: Om de efficiëntie van de isolatie te testen, brengt u 105 cellen/buis over in een buis (nagesorteerd testmonster) die later zal worden gebruikt voor flowcytometrie (zoals beschreven in de stappen 4.3.9-4.3.13). Zuig het laminine langzaam op uit fluïdische chips door de punt van een P200 in het reservoir aan de rand van het kanaal te plaatsen.NOTITIE: Als de vloeistof moeilijk te verzamelen is, til dan langzaam een kant van de chip op om de vloeistof naar het tegenoverliggende reservoir te laten gaan. Voeg de celsuspensie gestaag toe aan het kanaal om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen ontstaan.OPMERKING: Voer de stappen 3.3.4-3.3.5 snel maar voorzichtig uit om uitdroging van het laminaat en de vorming van luchtbellen in de kanalen van de chip te voorkomen. Als er luchtbellen worden gevormd, tilt u een kant van de chip op en tikt u zachtjes op de schuif om de bellen te mobiliseren; Wanneer ze het reservoir bereiken, stijgen ze naar de luchtinterface en zouden ze het kanaal niet moeten kunnen huren. Breng de chip over naar de incubator en laat ze een nacht staan, zodat de cellen volledig aan het kanaal vastzitten en er langwerpig uitzien. Wanneer de cellen volledig zijn gehecht, zuigt u het medium op zoals in stap 3.3.4 en vervangt u het door 200 μl cytokine-aangevuld SFM-34. Vervang vanaf nu dagelijks het medium totdat de cellen 90%-100% samenvloeiing hebben bereikt. 4. Toepassing van continue stroom op endotheelcellen – Aorta-op-een-chip Bereid materialen en reagentia voor.Bereid Mix 4 SFM-34 medium voor door 18 ml SFM-34 medium aan te vullen met Mix 4 cytokines volgens tabel 2 en plaats het in een buis van 50 ml in de incubator met het deksel iets losgeschroefd om de gasuitwisseling te vergemakkelijken. Plaats de geselecteerde perfusiesets en eventuele slangen die moeten worden gebruikt voor de fluïdische opstelling in de incubator om te ontgassen. Fluidic systeem assemblageInstalleer de perfusieset in het apparaat volgens het protocol van de fabrikant.NOTITIE: Vergeet niet om klemmen in het systeem te gebruiken. Als voor deze stap schuifklemmen worden gebruikt, moeten deze op de slang worden geschoven voordat ze op de chip worden aangesloten. Bevestig een nieuwe fluïdische chip en voeg het cytokine-gesupplementeerde SFM-34-medium toe, waarbij u ervoor zorgt dat beide reservoirs onder steriele omstandigheden in de kap worden gevuld. Voer het programma voor het verwijderen van luchtbellen en de kalibratiestap uit. Verwijder de vloeistofunit met de aangesloten set uit de couveuse en breng deze over in de kap; Neem ook de chips met de cellen uit de incubator. Klem de slang aan beide zijden van de testchip. Verwijder de slang van de testchip.NOTITIE: Controleer of er geen luchtbellen aanwezig zijn in de Luer-connector aan het uiteinde van de slang. Als er luchtbellen zichtbaar zijn, zuig ze dan voorzichtig op met een P200-pipet en voeg indien nodig meer medium toe om ervoor te zorgen dat de connector gevuld is met medium. Verbind de chip met de cellen met de slang. Verwijder of open de clamps. Breng het systeem over naar de incubator en sluit de luchtpomp aan op de vloeistofunit. Start het voorgeselecteerde programma met behulp van de pompspecifieke software (aanvullende afbeelding S2) met de geleidelijke toename van de schuifspanning zoals beschreven in tabel 3.OPMERKING: Afhankelijk van het specifieke experiment dat nodig is, moet het stimulatieprogramma mogelijk worden geoptimaliseerd. Hier wordt een geleidelijke toename van de schuifspanning beschreven die leidt tot de uiteindelijke waarde van 5 dyn/cm2, die de schuifspanning nabootst die wordt berekend om te worden ervaren door de wand van de dorsale aorta bij het begin van de foetale circulatie 9. Onafhankelijk van de uiteindelijke schuifspanning die zal worden gebruikt, is het noodzakelijk om in de loop van de tijd geleidelijk toe te nemen om de cellen in staat te stellen zich aan de kracht aan te passen zonder dat de cellen loskomen van de chip. Als het geselecteerde stimulatieprotocol langer dan 3 dagen duurt, moeten cytokinen in het systeem worden aangevuld door 1 ml SFM-34 toe te voegen met de Mix 4-cytokines die normaal gesproken aan 18 ml zouden worden toegevoegd. Om dit te doen, wordt het pompprogramma snel gepauzeerd en wordt 500 μL bijgevuld medium toegevoegd aan elk van de twee spuiten in de fluidic set. Celverzameling voor analyseVerwarm de dissociatiebuffer voor in een waterbad. Haal de vloeistofunit uit de couveuse en plaats deze in de kap. Klem de slang aan beide zijden naast de chip vast en verwijder de slang van de reservoirs op de chip. Verwijder voorzichtig het medium van de chip en vervang het door DPBS Ca 2+ Mg2+ om de cellen te wassen. NOTITIE: Deze stap van het wassen met PBS kan worden overgeslagen als de cellen beginnen los te laten. Voeg voorzichtig 150 μL dissociatiebuffer toe en incubeer gedurende 3 minuten bij 37 °C.NOTITIE: Controleer onder de microscoop of de cellen enkelvoudig en losstaand zijn; anders nog 2 minuten incuberen. Het is van essentieel belang dat de cellen volledig van het kanaal worden losgemaakt voordat het medium wordt opgezogen, omdat de chip niet kan helpen bij het losmaken van de cellen door pipetteren. Andere oplossingen kunnen worden gebruikt om de cellen los te maken, zoals trypsine of op EDTA gebaseerde buffers. Verzamel de dissociatiebuffer met de cellen uit één reservoir en breng over naar een centrifugebuis van 15 ml en was het kanaal eenmaal met DPBS om alle losgemaakte cellen te verzamelen. Voeg 1 ml wasbuffer toe aan de 15 ml buis met de cellen en neem 10 μl om de cellen te tellen. Verdeel de celsuspensie in flowcytometriebuisjes om 105 cellen per reageerbuis te hebben. Draai de buisjes 5 minuten rond op 300 × g. Bereid de kleuroplossing voor op 50 μl voor elke reageerbuis om te kleuren. Voeg de CD34 PerCP-efluor710 of CD34-PE toe in een verdunning van respectievelijk 1:100 en 1:200. Resuspendeer de cellen in 50 μl kleuroplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C. Was de cellen door 2 ml wasbuffer toe te voegen en centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 × g. Resuspendeer de pellets in 100 μL kleuroplossing en verkrijg de gegevens met behulp van een flowcytometer.OPMERKING: De cellen kunnen ook rechtstreeks in de chip worden gelyseerd voor RNA-extractie met behulp van 150 μL RNA-lysisbuffer of worden gefixeerd voor beeldvorming met behulp van 4% paraformaldehyde in DPBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Analyse van de celoriëntatieAnalyseer de beelden om veranderingen in celoriëntatie te kwantificeren met behulp van FIJI23 (aanvullende afbeelding S3).Open de manager Interessegebied (ROI) vanuit de knop Analyseren | Gereedschap | Menu ROI-manager . Teken de celcontouren handmatig met behulp van het gereedschap voor het selecteren van polygonen en voeg ze toe aan de ROI-manager door op Toevoegen te klikken of de sneltoets CTRL+T te gebruiken. Meet de oriëntatie van elke ROI door de ellips Fit te kiezen in de Analyseren | Menu Afmetingen instellen . Pas de meting toe op alle ROI’s via de Meer… Opdracht voor meerdere metingen in de ROI-manager.OPMERKING: Met deze stap past een ellips op elke ROI en wordt een tabel gegenereerd met de lengte van de hoofd- en secundaire ellipsassen, evenals de hoek. Exporteer de tabel naar een CSV-bestand om in andere software te worden geïmporteerd om te plotten.OPMERKING: Het script dat voor de plots wordt gebruikt, is beschikbaar op https://gist.github.com/nicolaromano/708b3231d730ee7f70763a7cf8850ddc.