Di seguito è descritto un semplice flusso di lavoro per differenziare le cellule endoteliali dalle cellule staminali pluripotenti umane, seguito da un protocollo dettagliato per la loro stimolazione meccanica. Ciò consente lo studio della meccanobiologia dello sviluppo delle cellule endoteliali. Questo approccio è compatibile con i saggi a valle di cellule vive raccolte dal chip di coltura dopo la stimolazione meccanica.
Il cuore è il primo organo ad essere funzionalmente stabilito durante lo sviluppo, avviando così la circolazione sanguigna molto presto nella gestazione. Oltre a trasportare ossigeno e sostanze nutritive per garantire la crescita fetale, la circolazione fetale controlla molti eventi cruciali dello sviluppo che si verificano all’interno dello strato endoteliale attraverso segnali meccanici. I segnali biomeccanici inducono cambiamenti strutturali dei vasi sanguigni, stabiliscono le specifiche arterovenose e controllano lo sviluppo delle cellule staminali ematopoietiche. L’inaccessibilità dei tessuti in via di sviluppo limita la comprensione del ruolo della circolazione nelle prime fasi dello sviluppo umano; Pertanto, i modelli in vitro sono strumenti fondamentali per lo studio della meccanobiologia dei vasi. Questo articolo descrive un protocollo per differenziare le cellule endoteliali dalle cellule staminali pluripotenti indotte umane e la loro successiva semina in un dispositivo fluidico per studiare la loro risposta a segnali meccanici. Questo approccio consente la coltura a lungo termine di cellule endoteliali sotto stimolazione meccanica, seguita dal recupero delle cellule endoteliali per la caratterizzazione fenotipica e funzionale. Il modello in vitro qui stabilito sarà strumentale per chiarire i meccanismi molecolari intracellulari che trasducono la segnalazione mediata da segnali meccanici, che alla fine orchestrano lo sviluppo dei vasi durante la vita fetale umana.
Durante lo sviluppo embrionale, il cuore è il primo organo a stabilire la funzionalità1, con contrazioni rilevabili fin dalla prima fase di formazione del tubo endocardico2. La circolazione, insieme ai segnali meccanici mediati dal flusso di sangue all’interno del vaso, controlla molti aspetti cruciali dello sviluppo precoce. Prima dell’instaurazione della circolazione fetale, la vascolarizzazione è organizzata in un plesso capillare primario; Durante il funzionamento cardiaco, questo plesso si riorganizza in vascolarizzazione venosa e arteriosa3. Il ruolo dei segnali meccanici nella specificazione arterovenosa si riflette nell’espressione pan-endoteliale dei marcatori arteriosi e venosi prima dell’inizio del flusso sanguigno4.
Le forze emodinamiche non solo controllano lo sviluppo della vascolarizzazione stessa, ma svolgono anche un ruolo fondamentale nel controllo della formazione delle cellule del sangue. Le cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) emergono da cellule endoteliali specializzate chiamate endotelio emogenico 5,6,7,8, presenti in diverse regioni anatomiche degli embrioni esclusivamente nella fase iniziale dello sviluppo. Modelli con deficit cardiaci, insieme a modelli in vitro, hanno dimostrato che i segnali meccanici istruiscono e aumentano la produzione di HSPC dall’endotelio emogenico 9,10,11,12,13,14.
È stato dimostrato che diversi tipi di dinamiche di flusso controllano in modo differenziato il ciclo cellulare15, noto per essere importante sia nell’endotelio emogenico 16,17 che nella specificazione delle cellule arteriose18. Nel complesso, i segnali meccanici sono determinanti critici dell’identità e della funzione cellulare durante lo sviluppo. Nuovi dispositivi fluidici in vitro ci consentono di superare i limiti legati allo studio della meccanobiologia dello sviluppo durante lo sviluppo del sangue umano in vivo.
L’obiettivo generale del protocollo in questo manoscritto è quello di descrivere, passo dopo passo, la pipeline sperimentale per studiare l’effetto dello shear stress sulle cellule endoteliali umane derivate in vitro da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCs). Questo protocollo contiene istruzioni dettagliate sulla differenziazione delle hiPSC in cellule endoteliali e la loro successiva semina in chip fluidici per il protocollo di stimolazione. In questo modo, diverse cellule endoteliali derivate in vitro possono essere testate per la loro capacità di rilevare lo sforzo di taglio analizzando il loro orientamento in risposta al flusso. Ciò consentirà ad altri laboratori di affrontare domande sulla risposta allo stress da taglio e sulle sue conseguenze funzionali su diverse identità di cellule endoteliali.
Il protocollo che qui descriviamo consente la generazione di cellule endoteliali meccanosensibili da cellule staminali pluripotenti umane e lo studio della loro risposta alla stimolazione meccanica mediata da stress di taglio controllato. Questo protocollo è interamente basato su citochine e pienamente compatibile con i reagenti GMP per la potenziale traduzione nella produzione di cellule per la terapia cellulare.
La derivazione delle hiPSC fornisce agli scienziati un modello strumentale per le prime fasi dello sviluppo embrionale che consente lo studio di processi altrimenti difficili da studiare in vivo24. Infatti, i tessuti embrionali umani disponibili per la ricerca vengono raccolti da embrioni privi di circolazione, e questo potrebbe avere un impatto significativo sulla firma molecolare controllata da segnali meccanici. L’approccio qui descritto consente l’imaging dal vivo e lo studio in tempo reale della risposta cellulare allo stress da taglio. La combinazione delle hiPSC con la fluidica fornisce un modello di studio che supera la limitata disponibilità e l’inaccessibilità dei tessuti fetali in via di sviluppo quando l’inizio della circolazione rimodella e controlla l’instaurazione del sistema cardiovascolare e sanguigno 3,9,10,25.
Una limitazione del protocollo è che le cellule endoteliali derivate da questo protocollo potrebbero non riflettere le varie identità delle diverse cellule endoteliali presenti nei tessuti in via di sviluppo. Per superare questa limitazione, potrebbe essere necessaria una specifica combinazione di citochine durante il processo di differenziazione che precede la stimolazione fluidica per ottenere l’identità desiderata o il fenotipotessuto-specifico 26. L’isolamento di sottogruppi endoteliali può essere ottenuto utilizzando un immunofenotipo più raffinato durante la fase di isolamento. Questo protocollo isola le cellule endoteliali basandosi solo sull’espressione di CD34, consentendo così l’isolamento della colonna invece del cell sorting attivato dalla fluorescenza (FACS); In questo modo si riduce la morte cellulare e il rischio di contaminazione. Inoltre, questo protocollo è specificamente progettato per studiare il ruolo dello sforzo di taglio mediato dal flusso laminare. Dovranno essere impiegati approcci fluidici alternativi per studiare l’effetto di altri segnali meccanici, come l’allungamento o la compressione, o altri tipi di flusso come il flusso perturbato o disturbato.
Abbiamo precedentemente dimostrato che le cellule endoteliali derivate da iPSC imitano le identità cellulari arterovenoseeterogenee 27 in modo simile a quello osservato nell’aorta dorsale fetale28,29,30. Ciò è di particolare importanza nel contesto dello sviluppo dei vasi e della specificazione cellulare, nota per essere controllata dalla circolazione sanguigna. Studi su diversi modelli hanno dimostrato che la mancanza di circolazione provoca un’alterazione delle specifiche arterovenose11,14,31. I meccanismi che collegano i segnali meccanici con la specificazione cellulare sono ancora sconosciuti e la pipeline qui descritta consente studi funzionali raffinati che non possono essere testati in vivo.
Questa pipeline descrive la produzione e la stimolazione di cellule endoteliali derivate da hiPSC utilizzando canali fluidici disponibili in commercio, evitando la necessità di fondere i dispositivi come per i dispositivi in polidimetilsilossano (PDMS) ampiamente utilizzati12. Inoltre, l’utilizzo di chip PDMS rende particolarmente impegnativa la raccolta delle cellule stimolate, mentre con questo protocollo le cellule possono essere facilmente recuperate dal canale. Ciò migliora significativamente la potenza analitica consentendo analisi successive come analisi proteomiche e trascrittomiche, citometria a flusso e saggi funzionali, che potrebbero richiedere ulteriori colture o saggi in vivo .
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dal Research Advanced Grant 2021 della European Hematology Association, dal Global Research Award 2021 dell’American Society of Hematology e dall’Internal Strategy Support Fund ISSF3 finanziato dal Welcome Trust e dall’Università di Edimburgo. Ringraziamo Fiona Rossi della Flow Cytometry Facility per il supporto nell’analisi della citometria a flusso. Ai fini dell’accesso aperto, l’autore ha applicato una licenza Creative Commons Attribution (CC BY) a qualsiasi versione del manoscritto accettato dall’autore derivante da questa presentazione.
0.6 Luer uncoated slide | ibidi | IB-80186 | |
25% BSA | Life Technologies | A10008-01 | |
6-well plates | Greiner Bio-one | 657160 | |
Accutase | Life Technologies | A1110501 | Cited as Dissociation reagent |
Ascorbic acid | Merck | A4544-100G | |
Aspiration pipette | Sardtedt | 86.1252.011 | |
B27 supplement | Life Technologies | 17504044 | Cited as Neuronal cell culture supplement (50x) |
BD FACS DIVA | BD Biosciences | Version 8.0.1 | Cited as flow cytometry software |
BD LSR Fortessa 5 Laser | BD Biosciences | ||
bFGF | Life Technologies | PHG0021 | |
CD34 Microbead kit | Miltenyil Biotec | 30-046-702 | |
CD34 PE clone 4H11 | Invitrogen | 12-0349-42 | |
CD34 PerCP-eFluor 710 clone 4H11 | Invitrogen | 44-0349-42 | |
Cellstar cell-repellent surface 6-well plates | Greiner Bio-one | 657970 | Cited as cell-repellent plate |
CHIR99021 | Cayman Chemicals | 13122-1mg-CAY | |
Cryostor CS10 cell cryopreservation | Merck | C2874-100ML | Cited as Cryopreservation solution |
Dimethyl Sulfoxide | VWR | 200-664-3 | Cited as DMSO |
DMEM/F-12 | Life Technologies | 10565-018 | |
DPB Ca2+ Mg2+ | Life Technologies | 14080055 | |
DPBS | Life Technologies | 14200075 | |
EASY Strainer 40 μm | Greiner Bio-one | 542040 | |
EDTA | Life technologies | 15575020 | |
FcR Blocking Reagent | Miltenyil Biotec | 130-059-901 | |
Fiji | Version 1.53c | ||
Flow Jo | Version 10.7.1 | Cited as flow cytometry sanalysis oftware | |
FLT3L | Peprotech | 300-19-10uG | |
Fluidic unit | ibidi | 10903 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | Cited as L-glutamine supplement |
Ham F-12 | Life Technologies | 11765054 | |
Holo-transferrin | Merk | T0665-500MG | |
Human Serum Albumin | Fujifilm UK LTD | 9988 | |
Ibidi Pump system | ibidi | 10902 | Cited as Pump system |
IMDM | Life Technologies | 12440053 | |
Inverted microscope | ioLight/Thisle Scientific | IOL-IO-INVERT | Cited as inverted in-incubator microscope |
Lyophilised BSA | Merck | A2153-100G | |
MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | Cited as Magnetic separator |
MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | Cited as Magnetic column |
MTG | Merck | M6145-25ML | |
N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | |
Notebook for pump system | ibidi | 10908 | |
Paraformaldehyde 37-41% | Fisher Chemicals | F/1501/PB15 | |
Pastette | Greiner Bio-one | 612398 | |
Pen/Strep | Gibco | 15070063 | |
Perfusion Set YELLOW/GREEN: 50 cm, ID 1.6 mm, 10 mL reservoirs | Ibidi | IB-10964 | Cited as Perfusion set |
Polystyrene Round Bottom Tubes | Falcon | 352008 | Cited as Flow cytometry tubes |
Prism 9 | Verison 9.4.0 | ||
Pump control software | ibidi | version 1.6.1 | Cited as Pump software |
ReLeSR | Stem cell tecchonologies | 5872 | Cited as Detaching solution |
rhBMP4 | R&D | 314-BP-010 | |
rhEPO | R&D | 287-TC-500 | |
rhIGF1 | Peprotech | 100-11-100uG | |
rhIL11 | Peprotech | 200-11-10uG | |
rhIL3 | Peprotech | 200-03-10uG | |
rhIL6 | R&D | 206-IL-010 | |
rhLaminin-521 | Life technologies | A29248 | Cited as Laminin |
rhSCF | Life Technologies | PHC2111 | |
rhTPO | R&D | 288-TPN-025 | |
rhVEGF | R&D | 293-VE-010 | |
RLT Lysis Buffer | Qiagen | 79216 | |
Serial Connector for µ-Slides: Sterile, Sterile | ibidi | IB-10830 | |
StemPro-CD34 SFM media | Life Technologies | 10639011 | Cited as Serum-Free media for CD34+ cells (SFM-34) |
StemPro-CD34 Nutrient Supplement | Life Technologies | 10641-025 | Cited as 34 nutrient supplement |
StemPro hESC SFM | Life Technologies | A1000701 | Cited as Culture media |
StemPro supplement | Life Technologies | A10006-01 | |
Vitronectin (VTN-N) recombinant human protein, truncated | Invitrogen | A31804 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Cited as iRock |
β-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |