במבחנה מודל של כלי דם אנושיים עובריים על שבב לחקר מכנוביולוגיה התפתחותית

הערה: כל טכניקות תרבית התאים חייבות להתבצע בתנאים סטריליים במכסה מנוע זרימה למינרית ותאים חייבים להיות מודגרים ב 37 ° C באטמוספירה לח עם 5% CO2. ההוראות להכנת כל הציטוקינים הן לתחזוקה (rhbFGF) והן לפרוטוקול ההבחנה (rhBMP4, rhVEGF, rhbFGF, rhIL6, rhFLT3L, rhIGF1, rhIL11, rhSCF, rhEPO, rhTPO, rhIL3) מופיעות בטבלה משלימה S1. 1. גידול hiPSCs – הפשרה, תחזוקה והקפאה של תאים הכנת אמצעי תחזוקה, גורמי גדילה וריאגנטים אחריםהכינו את מדיום התרבית על ידי הוספת תוסף בינוני ללא תאי גזע עובריים (גזע עובריים) מלא, 36 מ”ל של 25% אלבומין בסרום בקר (BSA), ו-1 מ”ל של 55 מ”ל של β-מרקפטואתנול למדיום הבסיסי Modified Eagle Medium/F12 (DMEM/F-12) של Dulbecco (ראו טבלת חומרים). להשעות 1 מ”ג של מעכב Rho קינאז (iRock) ב 1 מ”ל של DMSO, לעשות aliquots של 50 μL, ולאחסן אותם ב -20 ° C.הערה: aliquots אלה ניתן לשמור ב -20 ° C במשך שנה אחת. לאחר הפשרתם, הם יכולים להישמר ב 4 °C (75 °F) במשך שבוע אחד. הפשירו את תמיסת הוויטרונקטין (VTN-N) על קרח ואליקוט 60 מיקרוליטר לבקבוקון לפני האחסון בטמפרטורה של -80°C. ממש לפני ציפוי הצלחות, לדלל את מלאי 60 μL ב 6 מ”ל של מלוחים חוצצי פוספט של Dulbecco (DPBS); הריכוז הסופי של 5 מק”ג/מ”ל. הפשרת קו תאי hiPSCהערה: קו תאי הגזע הפלוריפוטנטיים האנושיים SFCi55 נגזר בעבר בבית ונעשה בו שימוש נרחב להתמיינות לסוגי תאים שונים ושושלות עובריות שונות 19,20,21,22.צפה באר אחת של צלחת 6 בארות עם 1 מ”ל של פתרון VTN-N במשך 1 שעה ב 37 ° C.הערה: לאחר הדגירה, ניתן לאחסן צלחות מצופות בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע. שאפו את תמיסת VTN-N עם פיפטה שואפת והוסיפו 1 מ”ל של מדיום תרבית שחומם מראש בתוספת 20 ng/mL של rhbFGF (טבלה משלימה S1). להפשיר במהירות את הבקבוקון המכיל hiPSCs באמבט מים ולהעביר את התא לתוך 5 מ”ל של מדיום תרבית שחומם מראש. סובבו את התאים למשך 3 דקות בטמפרטורה של 300 × גרם בטמפרטורת החדר. להשהות מחדש את גלולת התא ב 0.5 מ”ל של מדיום תרבית בתוספת 20 ng / mL של rhbFGF. מעבירים את התאים לבאר מצופה אחת המכילה כבר 1 מ”ל של מדיום. הוסף 5 μL של iRock לתוך הבארות המכילות את התאים בסך הכל 1.5 מ”ל של בינוני. תרביתו את התאים באינקובטור, החליפו את התווך מדי יום במהלך השבוע, והזינו את התאים פעמיים, תוך הוספת נפח כפול של תווך לתאים כדי להבטיח הזנה בסוף השבוע.הערה: התאים גדלים בנוכחות iRock למשך 24 שעות בלבד. תחזוקה ומעבר של hiPSCsהחליפו את המדיום מדי יום במדיום תרבית טרי שחומם מראש בתוספת 20 נ”ג/מ”ל של rhbFGF. עוברים את התאים כשהם מגיעים לכ-80% מפגש, בדרך כלל פעמיים בשבוע.כדי לעבור בין התאים, צפו צלחת ב-VTN-N כפי שתואר קודם לכן בשלבים 1.2.1 ו-1.2.2. שואפים את המדיום מהבארות עם תאים ושוטפים אותם עם DPBS. שאפו את ה-DPBS והוסיפו 1 מ”ל של מגיב דיסוציאציה (ראו טבלת חומרים) ודגרו במשך דקה אחת. לשאוף את מגיב הדיסוציאציה ולדגור במשך 3 דקות נוספות. טפחו בחוזקה על הצלחת 10 פעמים מכל צד.הערה: שלב הדיסוציאציה עשוי לדרוש מיטוב ספציפי לסוג תא בזמן הדגירה ובהליך ההקשה. מוסיפים 1 מ”ל מדיום תרבית לתאים ועם פיפטה פסטר, שוטפים פעם אחת עם המדיום כדי להבטיח שרוב המושבות נאספות. הוסף 150 μL של תרחיף התא לכל באר כדי לספק יחס מעבר של 1 באר לתוך 6.הערה: מיד לאחר הפשרת בקבוקון חדש, עדיף להעביר את התאים ביחס נמוך יותר כגון 1:1 או 1:2 עבור מעבר אחד או שניים כדי לאפשר להם להגיע לשלב גידול יציב לפני המעבר ביחס של 1:6. תרביתו את התאים באינקובטור, החליפו את התווך מדי יום במהלך השבוע, והאכילו את התאים פעמיים פעם אחת במהלך סוף השבוע. הקפאת קו תאי hiPSCsהערה: יש להקפיא תאים בתוך שני המעברים הראשונים שלהם לאחר ההפשרה כדי להבטיח שמירה על קבוצה קבועה במעבר נמוך של בקבוקונים קפואים כדי להתחיל את התרבית. להקפיא את התאים כאשר הם מגיעים למפגש של כ 80%.שנה את מדיום התרבית המחומם מראש בינוני לטרי בתוספת 20 ng/mL של rhbFGF ו- 5 μL של iRock ודגר במשך שעה אחת לפחות. נתק את התאים כמתואר בשלבים 1.3.2.2-1.3.2.5. לאסוף את התאים מנותקים בצינור צנטריפוגה 15 מ”ל המכיל 5 מ”ל של מדיום תרבית. צנטריפוגה למשך 3 דקות ב 300 × גרם בטמפרטורת החדר. שאפו את הסופרנאטנט והוסיפו 1 מ”ל של תמיסת שימור בהקפאה (ראו טבלת חומרים). בעזרת פיפטה של פסטר, מקפיצים בעדינות את התאים למעלה ולמטה כדי לערבב אותם בתמיסת ההקפאה.הערה: הימנע מפיפטינג מוגזם, שעלול לגרום לניתוק אשכולות התאים. מחלקים את תרחיף התא לשני בקבוקונים לשימור בהקפאה עם 0.5 מ”ל כל אחד. העבירו את בקבוקוני ההקפאה למיכל הקפאה מקורר מראש ב-4°C. מעבירים את המיכל עם התאים למקפיא בטמפרטורה של -80°C למשך 24 שעות לפני העברת הבקבוקונים לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. 2. התמיינות של hiPSCs לתאי אנדותל הכנת מדיום התמיינות ציטוקינים וגורמי גדילההכינו מדיום בידול ללא סרום (SFD) לפי טבלה 1. השתמש במדיום זה מיום 0 עד יום 5 של בידול. הכן מדיום ללא סרום לתאי CD34+ (SFM-34) על ידי הוספת 34 תוספי תזונה ו -5 מ”ל של תוסף L-גלוטמין למדיום הבסיסי 34 SFM (ראה טבלת חומרים). השתמש במדיום זה מהיום השישי של הבידול ואילך. להשהות 1 מ”ג של CHIR99021 ב 716 μL של DMSO כדי לקבל פתרון 3 mM. יש לדגור בטמפרטורת החדר עד להשעיה מלאה; במידת הצורך, התחממו במהירות ב-37°C. הפוך 20 μL aliquots ולאחסן אותם ב -20 ° C עד 6 חודשים. יש להשתמש מיד לאחר ההפשרה ואין להקפיא שוב או לאחסן. השהה מחדש את הציטוקינים בהתאם להוראה בטבלה משלימה S1. יש לאחסן את כל האליציטוטים של הציטוקינים בטמפרטורה של -80°C. התמיינות תאי אנדותלהערה: עבור כל יום של ההבחנה, הכינו 18 מ”ל (3 מ”ל בינוני/באר) של תווך SFD שחומם מראש, בהתאם לתערובות הציטוקינים המתוארות ב טבלה 2.יום 0 – היווצרות גופים עובריים (EBs)הכינו 18 מ”ל של מדיום SFD עם ערבוב ציטוקין 1 לפי טבלה 2, עבור כל צלחת של 6 בארות (3 מ”ל/באר). הוסיפו 2 מ”ל של מדיום SFD שחומם מראש עם ערבבו ציטוקין 1 בכל באר של צלחת דוחה תאים בעלת 6 בארות (ראו טבלת חומרים). כדי ליצור EBs, בצע את השלבים המתוארים בשלבים 1.3.2.2-1.3.2.4.הערה: ודא כי hiPSCs הם 70-80% confluent כדי להתחיל את הבידול. הוסף 1 מ”ל של מדיום SFD שחומם מראש עם ערבוב 1 ציטוקינים לכל באר של אשכולות תאים מנותקים. השתמש פיפטה פסטר כדי להעביר בעדינות את אשכולות התאים לתוך באר אחת של באר דוחה תאים עבור היווצרות EB ביחס של 1: 1. לאחר הנחת הצלחת באינקובטור, הזיזו אותה קדימה ואחורה, ימינה ושמאלה, כדי לפזר את ה- EBs באופן שווה בבאר. יום 1 – שינוי בינוני ל- EBsהערה: שלב זה נחוץ רק אם, עד היום הראשון של ההתמיינות, ישנם תאים בודדים רבים בתרחיף לצד EBs.הכינו 18 מ”ל של מדיום SFD עם ערבוב ציטוקין 1 לפי טבלה 2, עבור כל צלחת של 6 בארות (3 מ”ל/באר). מערבלים את הצלחת עם EBs כדי להעביר אותם למרכז ולאסוף אותם באמצעות פיפטה פסטר לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ”ל.הערה: אם EBs נראים מגובשים יחד כמו בחוטים, להפריד אותם על ידי pipetthem למעלה ולמטה עם P1000 לפני איסוף אותם לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ”ל. המתן 5-10 דקות עד שה- EBs יתיישבו בתחתית הצינור.הערה: אם ה-EBs קטנים מדי, צנטריפוגו אותם למשך 5 דקות ב-100 × גרם כדי לעזור להם להתיישב. שטפו את הצלחות דוחות התאים במים סטריליים או DPBS כדי להסיר תאים בודדים או לכלוך. שאפו בזהירות ובאיטיות את הסופרנאטנט מה-EBs מבלי לעקור אותם. הוסיפו 2 מ”ל של SFD עם ערבבו ציטוקינים 1 לכל באר של הלוחות דוחי התאים. השהה מחדש את ה- EBs באמצעות 1 מ”ל של מדיום SFD עם ערבוב 1 ציטוקינים לכל באר התחלה – לקבלת צלחת של 6 בארות, הוסף 6 מ”ל של מדיום. העבר את EBs ללוחות דוחי תאים בנפח 1 מ”ל לכל באר, אשר כבר מכיל 2 מ”ל של מדיום SFD. לאחר הנחת הצלחת באינקובטור, הזיזו אותה קדימה ואחורה, ימינה ושמאלה, כדי לפזר את ה- EBs באופן שווה בבאר. יום 2 – תוספת של CHIR99021מערבלים את ה-EBs למרכז הצלחת ומוסיפים CHIR99021 לפי טבלה 2 בצד הבאר כדי למנוע מגע ישיר עם התאים.הערה: אם המדיום לא השתנה ביום הראשון, החלף את המדיום כולו במקום להוסיף CHIR בלבד. הכינו 18 מ”ל של מדיום SFD עם ערבוב 2 לפי טבלה 2, לכל צלחת של 6 בארות (3 מ”ל/באר). לאחר הנחת הצלחת באינקובטור, הזיזו אותה קדימה ואחורה, ימינה ושמאלה, כדי לפזר את ה- EBs באופן שווה בבאר. יום 3 – שינוי בינוני ל-EBs ותוספת של מיקס 3 ציטוקיניםהכינו 18 מ”ל של מדיום SFD עם ערבבו 3 ציטוקינים לפי טבלה 2, לכל צלחת בת 6 בארות (3 מ”ל/באר). אסוף את EBs כמתואר בשלבים 2.2.2.2-2.2.2.4. הוסיפו 2 מ”ל של מדיום SFD שחומם מראש עם ערבבו 3 ציטוקינים לצלחות דוחות התאים. בזהירות לשאוף את supernatant מן EBs. הוסף 1 מ”ל / באר של SFD עם ערבוב 3 ציטוקינים. פיזור EBs בין הבארות כמתואר בשלבים 2.2.2.8-2.2.2.9. יום 6 – שינוי בינוני עבור SFM-34 ותוספת של מיקס 4 ציטוקיניםהכינו 18 מ”ל של מדיום SFD עם ערבבו 4 ציטוקינים לפי טבלה 2, לכל צלחת של 6 בארות (3 מ”ל/באר). אסוף את EBs כמתואר בשלבים 2.2.2.2-2.2.2.4. הוסיפו 2 מ”ל של מדיום SFM-34 שחומם מראש עם ערבבו 4 ציטוקינים ללוחות דוחי התאים. בזהירות לשאוף את supernatant מן EBs. הוסף 1 מ”ל/באר של SFM-34 עם ערבוב 4 ציטוקינים. פיזור EBs בין הבארות כמתואר בשלבים 2.2.2.8-2.2.2.9. 3. בידוד תאי CD34+ וזריעה לתוך השבב הערה: תאי CD34+ מבודדים באמצעות גישת בידוד חיובי עם ערכת מיקרו-חרוזים CD34 (ראה טבלת חומרים), המכילה מיקרו-כדוריות CD34 מצומדות לנוגדנים חד-שבטיים של עכבר נוגדנים אנטי-אנושיים CD34 מגיב חוסם FcR (IgG אנושי). חשוב לאמת את יעילות בידוד העמודה על ידי צביעת תאים לפני ואחרי הבידוד לניתוח ציטומטריית זרימה, להלן מצוין מתי יש לקחת תאים לניתוח זה. הכינו חומרים וריאגנטים.הכן את מאגר הכביסה על ידי הוספת 5 מ”ל של תמיסת 5% BSA ו- 200 μL של EDTA 0.5 מ”ל עד 45 מ”ל של DPBS לקבלת PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA. יש להתכונן טרי לכל בידוד, לעקר ולסנן ולשמור בקירור עד לשימוש. מצפים שבבים נוזליים עם תמיסת למינין שהוכנה על ידי דילול rhLaminin 521 1:50 ב- DPBS Ca2 + Mg2+. מצפים כל שבב בנפח המתאים לשבב הנמצא בשימוש ודגרים באינקובטור במשך שעתיים לפני הזריעה.הערה: ניתן להשתמש במטריצות אחרות עבור הציפוי ויש לבדוק אותן עבור סוג התא / הניסוי הספציפי. הכינו את Mix 4 SFM-34 medium על ידי תוספת של 18 מ”ל של מדיום SFM-34 עם Mix 4 ציטוקינים לפי טבלה 2 והניחו את התערובת בצינור של 50 מ”ל באינקובטור כשהמכסה מעט לא מוברג כדי להקל על החלפת הגזים. מניחים את ערכות הזילוח שנבחרו וכל צינורות אחרים שישמשו באינקובטור לדגה. יום 8 – דיסוציאציה של EBs ובידוד CD34+אסוף את EBs כמתואר בשלבים 2.2.2.2-2.2.2.5. הוסף 1 מ”ל של מגיב דיסוציאציה של תאים לכל באר התחלה של EBs שנאספו (אם נאספו 6 בארות, הוסף 6 מ”ל). העבר בחזרה 1 מ”ל של מתלה EB בריאגנט דיסוציאציה התא לכל באר של צלחת דוחה תאים. דגירה של 10 דקות באינקובטור. החזירו בעדינות את ה-EBs מעלה ומטה כנגד הבאר עם P1000, לא יותר מ-10 פעמים. חזור על שלבים 3.2.4-3.2.5.עבור סך של 3x.הערה: אם קשה לנתק את EBs, חזור על השלבים לעיל 4x בסך הכל. הוסף 5 מ”ל של חיץ כביסה עבור כל באר של EBs מנותקים. אספו את התאים לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מ”ל על ידי העברתם דרך מסננת של 40 מיקרומטר. קח 10 μL של תרחיף התא כדי לספור את התאים.הערה: כדי לבדוק את יעילות הבידוד, העבר 105 תאים/צינור לשני צינורות שונים (בקרה לא מוכתמת ודגימת בדיקה מדוברת) שישמשו מאוחר יותר לציטומטריית זרימה (כמתואר בשלבים 4.3.9-4.3.13). עבור צלחת 6 בארות, ~ 106 תאים יש לאסוף לאחר סינון. סובבו את התאים כלפי מטה במשך 10 דקות במהירות של 300 × גרם. השהה מחדש את התאים ב 300 μL של חיץ כביסה, בעדינות pipeting כמה פעמים כדי לוודא כי אין גושים. המשך לעקוב אחר פרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים). CD34+ זריעת תאים לתוך שבבים נוזלייםהערה: לשבב הנוזלי המשמש בפרוטוקול יש גובה תעלה של 0.6 מ”מ ואורך של 50 מ”מ, עבור שטח גידול כולל של 2.5 ס”מ2 (איור משלים S1). סוג זה של שבב הוא זרע עם נפח כולל של השעיית התא של 150 μL. שבבים שונים ניתן להשתמש, ואת נפח הזריעה ואת צפיפות התא צריך להיות מותאם על פי אזור הגידול. ייתכן שיהיה צורך במיטוב נוסף בהתאם לקו התאים שבו נעשה שימוש ולצמיחתו.השהה מחדש את תאי CD34+ המבודדים ב- 300 μL של מדיום SFM-34 שחומם מראש עם ערבוב 4 ציטוקינים. קח 10 μL של תרחיף התא ולספור את התאים. Resuspend 2.5 × 105 תאים בנפח סופי של 150 μL בתוספת SFM-34; הוסף 0.5 μL של iRock.הערה: כדי לבדוק את יעילות הבידוד, העבר 105 תאים/צינורית לתוך צינור (מדגם בדיקה לאחר מיון) שישמש מאוחר יותר עבור ציטומטריית זרימה (כמתואר בשלבים 4.3.9-4.3.13). שאפו לאט את הלמינין משבבי נוזלים על ידי הצבת קצה P200 בתוך המאגר בקצה התעלה.הערה: אם קשה לאסוף את הנוזל, הרימו באיטיות צד אחד של השבב כדי לעזור לנוזל לעבור למאגר הנגדי. הוסף את מתלה התא בהתמדה לתוך התעלה כדי לוודא שלא נוצרות בועות.הערה: בצע את שלבים 3.3.4-3.3.5 במהירות אך בעדינות כדי למנוע התייבשות הלמינין והיווצרות בועות בתעלות השבב. אם נוצרות בועות, הרימו צד אחד של השבב והקישו בעדינות על המגלשה כדי לגייס את הבועות; כאשר הם יגיעו למאגר, הם יעלו לממשק האוויר ולא יוכלו להיכנס לערוץ. מעבירים את השבב לאינקובטור ומשאירים אותם למשך הלילה, כך שהתאים מחוברים לחלוטין לתעלה ונראים מוארכים. כאשר התאים מחוברים במלואם, שאפו את המדיום כמו בשלב 3.3.4 והחליפו אותו ב-200 מיקרוליטר של SFM-34 בתוספת ציטוקינים. מעתה, להחליף את המדיום מדי יום עד שהתאים יגיעו 90%-100% מפגש. 4. יישום זרימה רציפה לתאי אנדותל – אבי העורקים על שבב הכינו חומרים וריאגנטים.הכינו את Mix 4 SFM-34 medium על ידי תוספת של 18 מ”ל של מדיום SFM-34 עם Mix 4 ציטוקינים לפי טבלה 2 והניחו אותו בצינור של 50 מ”ל באינקובטור כשהמכסה מעט לא מוברג כדי להקל על חילופי גזים. הניחו את ערכות הזילוח שנבחרו ואת כל הצינוריות שישמשו להתקנה הנוזלית באינקובטור כדי להוריד גזים. הרכבת מערכת פלואידיתהתקן את ערכת הזלוף ביחידה בהתאם לפרוטוקול היצרן.הערה: זכור להשתמש מלחציים במערכת. אם מלחציים הזזה משמשים לשלב זה, הם צריכים להיות מחליקים על הצינור לפני חיבור השבב. חברו שבב נוזלי חדש והוסיפו את מדיום SFM-34 בתוספת ציטוקינים, תוך הקפדה למלא את שני המאגרים בתנאים סטריליים במכסה המנוע. בצע את תוכנית הסרת הבועות ואת שלב הכיול. הסר את היחידה הנוזלית עם הקבוצה המחוברת מהאינקובטור והעבר אותה למכסה המנוע; קח גם את השבבים המכילים את התאים מהאינקובטור. הדקו את הצינור משני צידי שבב הבדיקה. הסר את הצינורית משבב הבדיקה.הערה: בדוק שאין בועות במחבר Luer בקצה הצינור. אם הבועות גלויות, שאפו אותן בזהירות באמצעות פיפטה P200 ואם יש צורך, הוסיפו עוד מדיום כדי לוודא שהמחבר מלא במדיום. חבר את השבב המכיל את התאים עם הצינור. הסר או פתח את המלחציים. מעבירים את המערכת לאינקובטור ומחברים את משאבת האוויר ליחידה הנוזלית. התחילו את התוכנית שנבחרה מראש באמצעות התוכנה ייעודית למשאבה (איור משלים S2) עם העלייה ההדרגתית של לחץ הגזירה המתואר בטבלה 3.הערה: בהתאם לניסוי הספציפי הדרוש, ייתכן שיהיה צורך למטב את תוכנית הגירוי. מתוארת כאן עלייה הדרגתית בלחץ הגזירה המובילה לערך הסופי של 5 dyn/cm2, המחקה את לחץ הגזירה המחושב על ידי דופן אבי העורקים הגבי בתחילת מחזור הדם העוברי 9. ללא תלות בלחץ הגזירה הסופי שיופעל, יש צורך להגדיל בהדרגה לאורך זמן כדי לאפשר לתאים להסתגל לכוח מבלי לגרום לתאים להתנתק מהשבב. אם פרוטוקול הגירוי שנבחר ארוך מ-3 ימים, יש להוסיף ציטוקינים למערכת על ידי הוספת 1 מ”ל SFM-34 המכיל את Mix 4 ציטוקינים שבדרך כלל יתווספו ל-18 מ”ל. כדי לעשות זאת, תוכנית המשאבה מושהית במהירות ו 500 μL של מדיום בתוספת מתווסף לכל אחד משני מזרקים להגדיר fluidic. איסוף תאים לניתוחמחממים מראש את חיץ הדיסוציאציה באמבט מים. מוציאים את היחידה הנוזלית מהאינקובטור ומעבירים אותה למכסה המנוע. הדקו את הצינור הצמוד לשבב משני הצדדים והוציאו את הצינור מהמאגרים שעל השבב. הסר בעדינות את המדיום מהשבב והחלף אותו ב- DPBS Ca2 + Mg2+ כדי לשטוף את התאים.הערה: ניתן לדלג על שלב זה של שטיפה עם PBS אם התאים מתחילים להתנתק. הוסף בעדינות 150 μL של חיץ דיסוציאציה ודגר במשך 3 דקות ב 37 ° C.הערה: בדוק תחת המיקרוסקופ אם התאים בודדים ומנותקים; אחרת, יש לדגור למשך 2 דקות נוספות. זה חיוני כי התאים מנותקים לחלוטין מן התעלה לפני שאיפת המדיום, כמו השבב אינו מאפשר לסייע ניתוק התא על ידי pipetting. ניתן להשתמש בתמיסות אחרות כדי לנתק את התאים, כגון טריפסין או מאגרים מבוססי EDTA. אספו את מאגר הדיסוציאציה המכיל את התאים ממאגר אחד והעבירו לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ”ל ושטפו את התעלה פעם אחת עם DPBS כדי לאסוף את כל התאים המנותקים. הוסף 1 מ”ל של חיץ כביסה לצינור 15 מ”ל עם התאים ולקחת 10 μL לספור את התאים. חלק את תרחיף התא בצינורות ציטומטריית זרימה כדי לקבל 105 תאים לכל מבחנה. סובבו את הצינורות במשך 5 דקות ב 300 × גרם. הכינו את תמיסת הצביעה כך שתהיה 50 μL לכל מבחנה להכתים. הוסף את CD34 PerCP-efluor710 או CD34-PE בדילול של 1:100 ו- 1:200, בהתאמה. להשהות מחדש את התאים ב 50 μL של תמיסת צביעה לדגור במשך 30 דקות ב 4 ° C. לשטוף את התאים על ידי הוספת 2 מ”ל של חיץ כביסה ולסובב במשך 5 דקות ב 300 × גרם. השהה מחדש את הכדוריות ב -100 מיקרוליטר של תמיסת צביעה ורכוש את הנתונים באמצעות ציטומטר זרימה.הערה: ניתן גם ליזה את התאים ישירות בשבב לצורך מיצוי RNA באמצעות 150 μL של מאגר RNA lysis או לקיבוע לצורך הדמיה באמצעות 4% paraformaldehyde ב-DPBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. ניתוח כיוון התאנתח את התמונות כדי לכמת שינויים בכיוון התא באמצעות FIJI23 (איור משלים S3).פתח את מנהל אזור העניין (ROI) מתוך נתח | כלים | תפריט מנהל ROI . צייר את קווי המתאר של התא באופן ידני באמצעות הכלי לבחירת מצולע והוסף אותם למנהל החזר ההשקעה על-ידי לחיצה על הוסף או באמצעות קיצור הדרך CTRL+T . מדוד את הכיוון של כל החזר השקעה על-ידי בחירה במדידת האליפסה ‘התאם’ בניתוח | תפריט ‘קבע מדידות ‘. החל את המדידה על כל החזר ההשקעה באמצעות עוד … הפקודה Multi measure במנהל החזר ההשקעה.הערה: שלב זה יתאים אליפסה לכל החזר השקעה וייצור טבלה המכילה את אורך צירי האליפסה הראשית והמינורית, כמו גם את הזווית. יצא את הטבלה לקובץ CSV כדי לייבא אותה לתוכנה אחרת לצורך התוויית.הערה: הסקריפט המשמש למגרשים זמין בכתובת https://gist.github.com/nicolaromano/708b3231d730ee7f70763a7cf8850ddc.